Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. NIT-1 hücre hatlarının mühendisliği ve bakımı
- Obez olmayan diyabetik (NOD) farelerle genetik bir arka planı paylaşan NIT-1 hücre hatlarını ve Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) doku kültürü ile muamele edilmiş yemeklerde 293FT hücrelerini% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 4.5 g / L glikoz içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde% 5 CO2 ile.
- Transfeksiyon için 293FT hücrelerini %70-80 birleşim noktasına kadar büyütün.
- 293FT hücreli 10 cm'lik tabak başına, yapısal olarak aktif EF1α promotorunun kontrolü altında ateşböceği lusiferaz transgenini (luc2) ifade eden 10 μg pLenti-lusiferaz-blast'ı birleştirin (Ek Dosya 1'e bakınız), pMD2.G, pMDLg/pRRE ve pRSV-Rev ambalaj plazmitlerinin her biri 2 μg, zarf proteini plazmidi pCMV-VSV-G'nin 4 μg'ı, ve 1 mL serumsuz DMEM'de 60 μg lineer polietilenimin (PEI). Miktarları, transfekte edilecek hücre sayısına göre ayarlayın.
- DNA, PEI ve DMEM'i 20 dakika oda sıcaklığında (RT) bırakın ve ardından 293FT hücrelerine ekleyin.
- Transfeksiyondan 48 saat sonra lentiviral partikülleri içeren ortamı toplayın.
- NIT-1 hücrelerini, 48-72 saat boyunca 106 hücre başına 1 mL lentiviral partikül içeren ortam ile ~% 80 birleşimde transdüksiyon yapın.
- 48 saat boyunca 5 μg / mL blasticidin ile lusiferaz eksprese eden hücreleri seçin.
- Ayrıca, lusiferaz eksprese eden hücreleri deneysel soruya uyacak şekilde genetik olarak değiştirin. Karşılaştırma için lusiferaz eksprese eden vahşi tip veya hedeflemeyen bir kontrol hücresi hattı ekleyin.
not: Hedef gen modifikasyonlarının örnekleri arasında kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) nakavt, CRISPRa/i, shRNA knockdown ve aşırı ekspresyon yer alır.
2. Nakil için NIT-1 hücrelerinin hazırlanması
- Lusiferaz eksprese eden hücreleri% 80 -% 90 birleşene kadar büyütün.
- Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın (PBS, 10 cm'lik bir tabak için 5 mL).
- Her yemeğe 2 dakika boyunca 1 mL %0.05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (tripsin-EDTA) ekleyin.
- Tripsini 5 mL büyüme ortamı ile nötralize edin.
- Hücreleri tabaktan yıkamak için bir pipet kullanın ve bunları konik bir tüpe aktarın.
not: Aynı hücre hattının birden fazla kabından alınan hücreler birleştirilebilir.
- Tripan mavisi gibi bir leke kullanarak hücreleri bir hemositometre ile manuel olarak veya otomatik bir hücre sayacı ile otomatik olarak sayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 250 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspirasyonlu bir pipetle çıkarın.
- Hücre peletini PBS'de 5 × 107 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse edin (fare başına hücre hattı başına 10,7 hücre 200 μL'lik bir hacimde nakledilecektir).
- Transplantasyona kadar hücreleri buz üzerinde (3 saate kadar) tutun.
3. NIT-1 hücrelerinin obez olmayan diyabetik şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-scid) farelerine nakli
- Alıcı fareleri (splenositleri izole etmek için kullanılan farelerle aynı cinsiyetten 8-10 haftalık NOD-scid fareleri) bir knockdown odasında izofluran inhalasyonu ile uyuşturun. 1,5 L/dk akış hızında ve 9 L/dk tahliye hızında hazneye %2,5 izofluran verin.
- Kurumayı önlemek için hayvanın gözlerini oftalmik merhemle yağlayın.
- Koruyuculu bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak, cildi açığa çıkarmak için farelerin arkasındaki (sırt tarafı) tüyleri alın. Tıraşlı ekim alanı yaklaşık 1 inç x 2 inç olacaktır. Traş edilmiş fareleri nakil olana kadar knockdown odasına geri koyun.
- Fareleri birer birer izofluran burun konisi ile temiz bir yüzeye aktarın. Farenin kafasını nazikçe burun konisine yönlendirin. Nakil sırasında anesteziyi korumak için 0.25 L / dk'lık bir izofluran akış hızı kullanın.
- Gevşek tüyleri çıkarmak ve cildi dezenfekte etmek için nakil alanını izopropil alkol hazırlama pedi ile silin.
- Şırıngayı yüklemeden önce hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. 26 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik steril bir şırıngaya fazla hacimli (>300 μL) hücre çekin. Baloncukları çıkarın; daha sonra fazla hücreleri tüpe geri koyun, böylece şırıngada 300 μL hücre süspansiyonu kalır.
- Baskın olmayan elde tutulan bir çift kavisli forseps kullanarak, deri altı boşluğuna daha kolay erişim sağlamak için farenin sırtının bir tarafındaki (sol veya sağ) cildi nazikçe kaldırın.
- Baskın eli kullanarak, şırıngayı farenin vücudunun koronal ve sagital düzlemlerine paralel olarak yerleştirin. İğne farenin kafasına doğru bakacak şekilde, iğneyi arka kısma yakın deriye sokun ve nazikçe deri altı boşluğuna yönlendirin. İğnenin tamamının cilt altında kaldığından ve delinmediğinden emin olun.
- Cildi iğnenin tabanının etrafında nazikçe tutmak için forsepsleri ayarlayın. Yavaşça az miktarda hücre süspansiyonu (<50 μL) dağıtın ve enjeksiyon bölgesinde cilt altında küçük bir şişkinlik oluştuğunu onaylayın. Deri altı boşluğuna 200 μL verilene kadar hücre süspansiyonunu enjekte etmeye devam edin.
- Forsepsleri yerinde tutarak ve iğneyi farenin vücuduna paralel tutarak iğneyi yavaşça geri çekin. İğne çıkarıldıktan sonra, hücrelerin delinme yarasından dışarı sızmasını önlemek için cildi birkaç saniye forseps ile kapalı tutun.
- Bir genetik modifikasyon değerlendiriliyorsa, farklı bir şırınga kullanarak farenin karşı tarafında nakli tekrarlayın, böylece hem mutant hem de kontrol hücreleri, bir hücre hattı solda ve diğeri sağda olacak şekilde her fareye enjekte edilir. Yalnızca bir hücre hattı naklediliyorsa, hücreleri yalnızca bir tarafa enjekte edin.
- Nakilden sonra, her fareyi yeni bir kafese aktarın. Kafese ek fareler eklemeden önce her farenin anesteziden tamamen iyileşmesine izin verin.
not: Fareler normal aktivitelerine devam ettiklerinde ve uyuşukluk veya hareket bozukluğu belirtileri göstermediklerinde iyileşirler.
- Nakil sonrası deney süresince farelerin sağlık durumunu günlük olarak değerlendirin. Greftler büyük bir şişkinlik oluşturursa veya fareler zayıf ve uyuşuk hale gelirse, kan şekerlerini ölçün ve tüm hipoglisemik farelere% 10 (a/a) sükroz suyu ad libitum sağlayın. Tüm veteriner tavsiyelerine uyun ve kurumsal yönergelere göre sürekli kötü vücut kondisyonu olan farelere ötenazi yapın. Bu çalışmada, farelere CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi uygulandı.
4. Otoreaktif splenositlerin izolasyonu ve saflaştırılması
- İdrar (veya kan) şekeri test şeritleri kullanarak yakın zamanda başlayan (10 günden az) diyabetli 10-16 haftalık erkek veya dişi NOD farelerini tanımlayın. NOD fareleri, art arda en az 2 gün idrar / kan şekeri ≥ 250 mg / dL olduğunda diyabetik olarak kabul edilir.
not: Her NOD-scid fare için 10 milyon splenosit gereklidir; Bir dalak tipik olarak 50 milyon ila 150 milyon splenosit verir. Splenositler, sentinal olarak izlenen bir tesiste barındırılan patojen içermeyen farelerden izole edildi.
- Uygun sayıda diyabetik NOD faresine ötenazi yapın.
not: Bu çalışmada, farelere CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapıldı ve ardından ölümü sağlamak için servikal çıkık yapıldı.
- Fare sırtındayken, cerrahi makasla ciltte yaklaşık 2 inç uzunluğunda dikey bir kesi yapın. Farenin sağ tarafını araştırmacının bakış açısından açın ve parlak kırmızı dalağı bulun. Dalağı pembe pankreastan nazikçe kesin ve 5 mL steril PBS içeren 10 cm'lik steril bir Petri kabına aktarın. Diseksiyonu gerektiği kadar çok fare ile tekrarlayın.
not: Birden fazla fareden elde edilen dalaklar tek bir tabakta birleştirilebilir. Steril bir başlıkta steril reaktifler ve ekipman kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Dalağı / dalakları steril bir şırınga pistonunun düz üst kısmı ile ezin.
- 50 mL'lik konik bir tüpe 40 μm veya 70 μm'lik bir süzgeç yerleştirin ve süzgeci astarlamak için 5 mL PBS ile yıkayın. Dalak süspansiyonunu süzgecin içine aktarın ve süzgeci nazikçe ezmeye devam edin. Bulaşığı 10 mL PBS ile yıkayın ve yıkamayı süzgecin üzerine aktarın. Süzgeçten kırmızı renk çıkana kadar ezmeye devam edin.
- Süzgeci atın ve tüpü RT'de 5 dakika boyunca 500 × g'da döndürün. Süpernatanı aspirasyonlu bir pipetle çıkarın.
- Hücre peletini RT'ye önceden ısıtılmış 5 mL (üç dalağa kadar) ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini 4 dakika boyunca parçalayın. Ek dalak gerekiyorsa hacmi dalak başına 1-2 mL artırın.
- 5 mL lizis tamponu başına 5 mL NIT-1 hücre ortamı (yukarıda açıklanmıştır) ile reaksiyonu durdurun. Topakları çıkarmak için hücre süspansiyonunu yeni bir süzgeçten geçirin. Süzgeci atın ve RT'de 5 dakika boyunca 500 × g'da döndürün.
- Hücre peletini 20 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. RT'de 5 dakika boyunca 500 × g'da döndürün. Hücreleri steril PBS'de 1.5 mL'lik güvenli kilitli reaksiyon tüpünde 1 × 108 hücre / mL konsantrasyonda (enjeksiyon hacmi 0.1 mL / faredir) yeniden süspanse edin.
- Hücreleri buz üzerinde saklayın (en fazla 1 saat) veya hücreleri RT'de tutun ve hemen kuyruk damarı enjeksiyonuna devam edin.
5. Lateral kuyruk veni yoluyla diyabetik splenositlerin intravenöz enjeksiyonu
- Damarları vazodilatlamak için yetişkin alıcı NOD-scid farelerinin vücudunu ısıtın (örneğin, ~ 5-10 dakika boyunca bir ısı lambası kullanarak) (bu, görselleştirmeye ve damar içine enjeksiyona yardımcı olur).
not: Farelerin aşırı ısınmasını önlemek için bu süreyi aşmayın. Her zaman sağlık durumunu izleyin. Fareler bitkin veya hareketsiz görünüyorsa, ısı lambasını hemen kapatın.
- Hücre süspansiyonunu ısıtın. Steril bir iğne (27-30 G, 0,3 mm / 0,5 inç veya daha küçük) ile steril bir şırınga (0,3-1,0 mL) hazırlayın veya 0,3 mm (0,5 inç) iğne ile steril bir 0,5 mL insülin şırıngası kullanın. İğneyi daima steril tutun ve şırınganın enjeksiyonlar arasında bırakılması gerekiyorsa steril bir tepsi kullanın.
- Her enjeksiyondan önce splenosit çözeltisini tekrar süspanse edin. Her fare için, şırıngaya 100 μL önceden ısıtılmış ve karıştırılmış splenosit süspansiyonu çekin. Şırıngada veya süspansiyonda hava kabarcığı olmadığından emin olun.
not: Fareyi kısıtlama cihazına yerleştirmeden önce tüm ekipman ve malzemelerin (dezenfeksiyon için alkollü mendiller, enjekte edilecek splenositlerle dolu bir şırınga ve enjekte edilen fareleri ayırmak için yeni bir kafes) hazırlandığından emin olun.
- Fareyi emniyet cihazına yerleştirin. Baskın olmayan elinizle kuyruğu yakalayın ve iki yanal kuyruk damarından birini bulun. Gerekirse kuyruğu yavaşça döndürün. Cildi temizlemek ve damarın görünürlüğünü artırmak için kuyruğu bir dezenfeksiyon mendili (% 70 izopropil alkol) ile silin.
- İğneyi baskın el ile kuyruğun orta bölgesine dar bir açıyla yerleştirin. İğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde, iğneyi ciltte birkaç milimetre kaydırın.
not: İğnenin damara paralel olduğundan ve cildin biraz altına yerleştirildiğinden emin olun. Deri/damar duvarına nüfuz ettikten hemen sonra farenin/kuyruğun ani hareketlerine hazırlıklı olun. İğnenin başarılı bir şekilde yerleştirilmesi, damar içine "pürüzsüz bir kayma" gibi hissettirmelidir. Başka bir denemeye ihtiyaç duyulursa, kuyruğu vücuda doğru ilerletin.
- Splenosit süspansiyonunu enjekte etmek için şırıngaya hafif bir basınç uygulayın. Enjeksiyon sırasında iğnenin daha fazla içeri veya dışarı hareket etmesine izin vermeyin. Başarılı enjeksiyonlar, enjeksiyon sırasında herhangi bir geri basınç hissetmeden pürüzsüzdür ve enjeksiyondan hemen sonra şeffaf / beyaz bir kan akışı ile gösterilir.
- İğneyi damardan nazikçe serbest bırakın ve kanama durana kadar bir dezenfeksiyon mendili ile kuyruğa hafif basınç uygulayın. Fareyi emniyet cihazından çıkarın ve nazikçe yeni hazırlanmış bir kafese aktarın.
not: Enjeksiyondan yaklaşık 2-4 hafta sonra süren otoreaktif splenositlerin diyabeti indükleme potansiyelini doğrulamak için splenositlerle NIT-1 hücre nakli almayan iki ila üç kontrol faresine enjekte edin.
6. NIT-1 greftlerinin in vivo biyolüminesan görüntülemesi
>NOT: Greftleri haftada bir ila iki kez görüntüleyin. Nakil gününde, greftlerin yerleşmesine izin vermek ve stabil lusiferaz ekspresyonunu sağlamak için nakilden sonra en az 2 saat bekleyin. Zaman sınırlayıcı bir faktörse, ilk ölçüm bunun yerine 1. günde yapılabilir. Önerilen bir ilk görüntüleme programı, enjeksiyondan sonraki 0. gün veya 1. gün, 5. gün, 10. gün, 14. gün, 18. gün ve 25. gündür. Bununla birlikte, biyolüminesan sinyalin kaybıyla değerlendirilen otoimmünitenin ilerlemesine dayalı olarak programı ayarlayın.
- Dulbecco'nun PBS'sinde 15 mg / mL D-lusiferin çözeltisi hazırlayın. Çözünmesi için RT'de çalkalayın ve steril filtre (0.22 μm). 1 mL alikotları -20 °C'de saklayın ve gerektiği gibi çözdürün.
not: Alikotlar yeniden dondurulabilir.
- Görüntülemeden en az 5 dakika önce, fareleri 1 mL'lik bir şırınga ve 150 mg / kg'lık bir dozda D-lusiferin çözeltisi ile 26 G'lik bir iğne kullanarak intraperitoneal olarak enjekte edin.
not: Her fare için yeni bir şırınga ve iğne kullanın.
- Fareleri kurumsal yönergelere göre izofluran soluma ile uyuşturun. Önerilen koşullar, sökme odasına 1,5 L/dk akış hızı ve 9 L/dk tahliye hızı ile %2,5 izoflurandır.
- Kurumayı önlemek için hayvanın gözlerini oftalmik merhemle yağlayın.
- Görüntüleme cihazıyla ilişkili yazılımı açın. Yeni bir kullanıcı oluşturun ve/veya oturum açın. Sağ alttaki kontrol panelinde Başlat'ı seçin (Şekil 1A). Görüntüleme verilerini otomatik olarak kaydetmek için bilgisayarda uygun klasörleri oluşturun ve ardından Alma | Otomatik kaydet... (Şekil 1A). Cihaz başlatmayı bitirdiğinde, maruz kalma süresini 1 dk.
not: Tam görüntüleme parametreleri Şekil 1B'de gösterilmiştir.
- Fareleri teker teker sökme odasından görüntüleme cihazına aktarın. Fareyi uzuvları yayvan olacak şekilde karnının üzerine yerleştirin ve başını nazikçe burun konisine yönlendirin. Görüntüleme sırasında anesteziyi sürdürmek için bir burun konisi aracılığıyla verilen 0.25 L / dk'lık bir izofluran akış hızı uygundur. Fareyi iki elinizle sırtının ortasına bastırarak ve ardından ellerinizi dışa ve birbirinden ayırarak nazikçe düzleştirin.
- Al'ı seçin (Şekil 1B). Deneyin ilgili tüm ayrıntılarını açılır pencereye kaydedin (Şekil 1C).
not: Çeşitli zaman noktalarında iki greft ile nakledilen üç adet 8 haftalık dişi NOD-scid farenin temsili görüntüleri için Şekil 2A'ya bakın.
