Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Malzemeler ve Reaktifler
- Enfekte farelerin ortaya çıktıktan 3-5 gün sonra ve daha önce tarif edildiği gibi geri döndüğü dişi Anopheles stephensi sivrisineklerini (Sda500 suşu) kullanın.
- Kurucu Isı Şoku Proteini 70 (HSP70) promotörünün. Bu, parazit yaşam döngüsü boyunca parlak floresan verir.
- Dişi C57BL / 6JRj fareleri kullanın (7 haftalık).
not: Açıklanan protokolde kullanılan tüm reaktifler,Malzeme/Ekipman Sekmesinde listelenmiştir.
2. Sivrisinek Tükürük Bezlerinden Radyasyonla Zayıflatılmış Sporozoit İzolasyonu
- Enfeksiyöz kan yemeğinden 18-25 gün sonra, sivrisinekleri daha önce tarif edildiği gibi buz üzerinde 15 ml'lik bir tüpe toplayın ve soğuk anestezi uygulayın. Tüpü ters çevirerek dikkatlice bir Petri kabına aktarın. Böcekleri buz üzerinde tutun ve sivrisinekleri 12 krad dozda γ veya x ışınlamasına maruz bırakın.
- Zayıflatılmış sporozoitleri, daha önce tarif edildiği gibi ışınlanmış sivrisinek tükürük bezlerinden izole edin. Enfekte tükürük bezlerini buz üzerinde küçük bir hacimde (yaklaşık 15 μl) 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) toplayın ve sporozoitleri serbest bırakmak için hafifçe ezin.
not: Yüksek konsantrasyonlu bir parazit süspansiyonunun küçük bir hacimde enjeksiyonu kritik öneme sahip olduğundan, bu nedenle, yeşil floresanın sağlam ifadesi ile kanıtlandığı gibi, önceden seçilmiş iyi enfekte olmuş sivrisineklerden yeterli sayıda tükürük bezinin toplanması önemlidir.
- Topakları ve sivrisinek kalıntılarını ortadan kaldırmak için sporozoit süspansiyonunu, düşük yapışma özelliğine sahip 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne uyarlanmış 35 μm'lik bir hücre süzgeci kapağından süzün.
- Daha önce tarif edildiği gibi izole edilmiş sporozoitlerin toplam sayısını sayın ve 83.000 sporozoit / μl elde etmek için parazit süspansiyonunun konsantrasyonunu soğuk 1x DPBS ile ayarlayın. Sonraki adımlara devam ederken parazitleri buz üzerinde saklayın.
- Negatif kontrol olarak kullanılacak enfekte olmamış sivrisineklerden eşdeğer sayıda tükürük bezi toplayın ve numuneyi adım 2.2 ve 2.3'te açıklandığı gibi işleyin. Süspansiyonda benzer konsantrasyonda tükürük bezi özleri elde etmek için numuneyi yukarıda belirtildiği gibi seyreltin.
not: Sporozoitler buz üzerinde en fazla 2 saat saklanabilir. Bununla birlikte, ideal olarak, tükürük bezleri ezildikten sonra bir saat içinde enjekte edilirler.
3. Sporozoitlerin Kulağın Dermal Tabakasına Enjeksiyonu
- Ketamin (50 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile hayvanları uyuşturun. Farenin bilinç kaybı durumunda olması için 5-8 dakika bekleyin ve kornea kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Her iki arka ayağınıza hafif bir ayak parmağı çimdikleme yaparak anestezi derinliğini değerlendirin.
not: Anestezi dozu 20 dakikadan az sürer, bu nedenle sonraki adımlar hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
- Daha önce stereomikroskop altına yerleştirilmiş şeffaf bantla ventral tarafı sabitleyerek farenin kulak kepçesini stabilize edin (Şekil 1A). Damar sisteminin zarar görmesini önlemek için kulağa hafifçe bastırın.
- 0,6 μl yeniden süspanse edilmiş parazit içeren 10 μl şırınga / 35 gauge eğimli iğne yükleyin.
- Sporozoit süspansiyonunu, iğneyi kulağın dorsal tarafına (Şekil 1A), epidermisin altına, eğim yukarı bakacak şekilde, herhangi bir kan damarından kaçınmaya dikkat ederek dikkatlice sokarak 4 enjeksiyon bölgesinde (bölge başına 0.15 μl) verin. Çıkarmadan önce enjekte edicinin geri akışını önlemek için iğnenin birkaç saniye dermiste kalmasına izin verin. İşlemin sonunda her enjeksiyon bölgesinde karakteristik bir papül gözlemleyin (Şekil 1B ve 1C).
- Enjeksiyondan sonra, kulağı banttan dikkatlice çıkarın.
- 3.2-3.4 adımlarını izleyerek kontralateral kulağa aynı dozda parazit enjekte edin.
- Tek başına enjeksiyonun aracılık ettiği enflamatuar yanıtı ve dermiste sivrisinek materyalinin birikimini değerlendirmek için enfekte olmamış sivrisineklerden 0.6 μl 1x DPBS veya 0.6 μl 1x DPBS + tükürük bezi özü ile 2 ek fareye enjekte edin.
- Fareyi tekrar kafese yerleştirmeden önce anesteziden sonra toparlanmasını izleyin.
not: Derideki uygun sporozoit birikimi, floresan mikroskobu (Şekil 2A ve 2B) ile izlenebilir, fare daha önce tarif edildiği gibi hazırlanır.
