1. Fare Embriyonik Fibroblastlarında (MEF) İnsan iPSC'lerinin (hiPSC'ler) Kültürlenmesi
NOT: HiPSC'lerin kültürlenmesi için, jelatin, jelatinimsi bir protein karışımı, rekombinant laminin 511 veya hiPSC genişlemesinde kullanılan diğer herhangi bir hücre dışı matris ile önceden kaplanmış 6 oyuklu bir plakaya tohumlama dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere alternatif yöntemler de kullanılabilir ve insan pluripotent kök hücre kültürü için özel olarak formüle edilmiş tanımlanmış ortam kullanılarak kültürlenir.
- MEF'in Kültürlenmesi
- 10 cm'lik bir hücre kültürü Petri kabını 4 mL %0.1 jelatin ile kaplayın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- 4 x 106 ışınlanmış MEF'lik bir şişeyi hızlı bir şekilde 10 mL 37 °C MEF ortamına çözün (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium [DMEM] +% 10 fetal sığır serumu (FBS) + 1x penisilin-streptomisin + 1x L-glutamin takviyesi). 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 9 mL MEF ortamında yeniden süspanse edin.
- Jelatin kaplı kabı inkübatörden çıkarın. Jelatini aspire edin ve 7 mL MEF ortamı ekleyin. Plaka 3 mL MEF süspansiyonu (adım 1.1.2'den itibaren) jelatin kaplı tabağa yerleştirin. MEF'in tabak üzerinde eşit dağılımını sağlamak için tabağı yan yana ve önden arkaya sallayın. 37 ° C'de 8-36 saat inkübe edin.
- MEF
üzerinde hiPSC geçirme
NOT: Veriler, insan lökosit antijeni (HLA)-A*02:01 bağlamında MART-1 peptidini spesifik olarak tanıyan uzun süreli kültürlenmiş melanom tümör infiltre eden lenfositten (TIL) türetilen T hücreleri 1 (MART-1) iPSC tarafından tanınan melanom antijeni kullanılarak oluşturulmuştur.
- Kolonilerin çapı 0,8 - 1,2 mm arasında olduğunda geçiş hiPSC'leri. Geçişten önce, hiPSC kolonilerini bir stereo-mikroskopta kontrol edin ve 200 μL'lik bir ucun plastik kenarını kullanarak kültürdeki herhangi bir farklılaşma alanını çıkarın.
- Harcanan ortamı aspire edin ve 10 μM Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü ile desteklenmiş 10 mL hiPSC ortamı (insan embriyonik kök hücre [ES] kültür ortamı [Malzeme Tablosu] + 10 ng / mL insan bazik fibroblast büyüme faktörü [hbFGF]) ekleyin.
- Hücre kültürü kabını bir elinizle tutun ve tek kullanımlık bir hücre geçirme aletini tüm tabak boyunca tek yönde yuvarlayın. Tüm silindir bıçağının kültür kabına temas etmesi ve haddeleme işlemi sırasında eşit basıncı koruması için yeterli basınç uygulayın.
- Kültür kabını 90°'de döndürün ve adım 1.2.3'ü tekrarlayın. Damalı görünmesi gereken kolonilerin uygun şekilde kesildiğini görsel olarak doğrulamak için plakayı mikroskopta görüntüleyin. 200 μL'lik bir pipet kullanarak nazik mekanik yıkama ile kesilen kolonileri ayırın.
not: Kesilen kolonilerin mekanik yıkama ile ayrılması, kolonileri merdane ile kestikten hemen sonra yapılmalıdır, çünkü 3 dakika sonra kesilen koloniler tabağa yeniden yapışmaya başlayacak ve homojen büyüklükteki kolonilerin yıkama ile ayrılması zorlaşacaktır.
- 350 - 600 küme kesilmiş koloniyi, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 10 mL taze hiPSC ortamı ile 10 cm'lik yeni bir MEF kabına (hiPSC geçişinden 8 - 36 saat önce kaplanır) aktarın. 37 °C.
'de inkübe edin
NOT: 600 küme yaklaşık 1.0 x 106 MART-1 iPSC'yi temsil eder ve 35. günde 0.5-1.0 x 106 DP hücresi verir. Bununla birlikte, beklenen sayılar, başlangıç hücre hattının gücüne ve kültür koşullarına bağlı olarak değişecektir.
- Ertesi gün, kullanılmış besiyerini aspire edin ve 10 mL taze hiPSC besiyeri ekleyin. hiPSC medyasını, hiPSC büyüme hızına bağlı olarak her 1-2 günde bir değiştirin.
2. hiPSC'lerle Ko-kültür için OP9/DLL1 Hücrelerinin Hazırlanması
- 37 ° C'de OP9 / DLL1 hücrelerini OP9 ortamında [α-minimum esansiyel ortam (α-MEM) +% 20 fetal sığır serumu (FBS) + 1x penisilin-streptomisin] kültürleyin. OP9 / DLL1 hücreleri birleştiğinde, ortamı aspire edin ve 5 mL 1x magnezyum, kalsiyum ve fenol kırmızı içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın.
- PBS'yi aspire edin ve 2 mL% 0.05 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Ardından, 4 mL OP9 ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon yapmak için pipetleme yoluyla hücre katmanını mekanik olarak ayırın.
- Hücre topaklanmalarını önlemek için hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 12 mL OP9 ortamında yeniden süspanse edin.
- Altı yeni 10 cm hücre kültürü Petri kabına 8 mL OP9 ortamı ekleyin. Her yeni 10 cm'lik tabağa 2.3. adımdan itibaren 2 mL OP9/DLL1 hücre süspansiyonu yerleştirin. OP9/DLL1'in tabak üzerinde eşit dağılımını sağlamak için tabağı yan yana ve ardından önden arkaya sallayın.
- 37 °C'de inkübe edin. Hücreler birleştiğinde her 2-3 günde bir pasajı tekrarlayın.
not: Yeterli miktarda donmuş OP9 / DLL1 hücresi stoğu yapmak ve her 4-6 haftada bir yeni bir stoğu çözmek önemlidir.
>3. HiPSC'lerin CD8αβ+ Tek Pozitif (SP) T Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması
- HiPSC'lerle ko-kültürden bir hafta önce jelatinleştirilmiş OP9/DLL1 kapları hazırlayın. % 0.1 jelatin çözeltisi hazırlamak için, 500 mL PBS'ye 5 mL oda sıcaklığında (RT) doku sınıfı stok jelatin çözeltisi ekleyin.
- 3 yeni 10 cm hücre kültürü Petri kabını% 0.1 jelatin tabağı başına 4 mL ekleyerek kaplayın. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Jelatini aspire edin ve her yemeğe 8 mL OP9 ortamı ekleyin. OP9/DLL1'in birleşik bir kabını (yukarıdaki bölüm 2'de yapıldığı gibi) önceden kaplanmış üç jelatin tabağa geçirin.
- 4 gün sonra, tabak başına 20 mL medya için jelatin üzerinde her 10 cm'lik OP9 / DLL1 tabağına 10 mL OP9 ortamı ekleyin.
- 7-8 gün sonra, OP9 / DLL1 birleşik tabaklarında hiPSC ko-kültürüne başlayın (farklılaşma günü 0).
- MEF'te birleşen 10 cm'lik hiPSC kabından harcanan ortamı aspire edin. 10 mL OP9 ortamı ekleyin. Adım 1.2.3 ve 1.2.4'te yapıldığı gibi tek kullanımlık bir hücre geçirme aracı kullanarak hiPSC kolonilerini kesin ve ayırın.
- 350 - 600 küme kesilmiş koloniyi, 200 μL'lik bir pipet kullanarak 10 mL taze OP9 ortamı ile 10 cm'lik önceden jelatinleştirilmiş bir OP9/DLL1 kabına (adım 3.1) aktarın. Kolonilerin eşit dağılımını sağlamak için kültür kabını yan yana ve ardından önden arkaya sallayın.
not: Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş hiPSC embriyoid cisimleri (EB'ler) veya küçük küme süspansiyonu kullanılabilir. Bununla birlikte, tek tip boyutta hiPSC kümeleri üretmek için tek kullanımlık bir hücre geçirme aracı veya EB oluşum sistemi kullanılması tercih edilir.
- 1. günde, kullanılmış ortamı aspire edin ve 20 mL taze OP9 ortamı ile değiştirin. 1 gün boyunca OP9/DLL1 üzerinde birlikte kültürlenen hiPSC kümeleri, küçük yuvarlak tek katmanlı koloniler olarak görünecektir (Şekil 1).
- 5. günde, 10 mL kullanılmış besiyerini aspire edin ve 10 mL taze OP9 besiyeri ekleyin. hiPSC kolonileri, çok katmanlı bir karanlık merkez ile karakterize edilen ilkel mezoderm olarak farklılaşmaya başlayacaktır.
- 9. günde, 10 mL kullanılmış besiyerini aspire edin ve 10 mL taze OP9 besiyeri ekleyin. Bu noktada çok katmanlı merkez yapılar kubbe benzeri şekillere evrilecek ve çevre ağı benzeri bir alan belirginleşecektir.
- 13. günde, hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) hasat edin (Şekil 1). 13. günde hiPSC'den türetilmiş yapılar, daha önce insan embriyonik kök hücre kaynaklı hematopoietik progenitörleri kapsadığı bildirilen hematopoietik bölgeleri (HZ'ler) temsil eden, kubbe benzeri alanlardan oluşan bir ağ ile çevrili koyu renkli bir merkezi organoid ile karakterize edilir.
NOT: Kubbe benzeri yapıların varlığı, karanlık merkezlerin yokluğunda bile başarılı bir süreci gösterir. HPC'lerin üretilememesi, OP9 / DLL1'in düşük kalitesi, FBS lotunun kalitesi, OP9 / DLL1 üzerine ekilen iPSC kümelerinin birleşmesi (350-600 küme optimaldir) ve / veya hematopoietik öncüler üretmek için iPSC hatlarının potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanabilir.
- Kullanılmış ortamı aspire edin ve 1x'i kalsiyum ve magnezyum (HBSS) ile modifiye edilmiş 5 mL 1x fenol kırmızısı içermeyen Hanks'in dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın.
- HBSS'yi aspire edin ve 10 mL HBSS'ye 250 μL 5000 Birim / mL kollajenaz IV ekleyin. 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. HBSS'yi kollajenaz IV ile aspire edin ve bir kez 5 mL PBS ile yıkayın.
- PBS'yi aspire edin ve 5 mL% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin. 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. Ardından, 4 mL OP9 ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon yapmak için pipetleme yoluyla hücre katmanını ayırın.
- Hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 10 mL OP9 ortamında yeniden süspanse edin.
- Yeni bir jelatinleştirilmiş 10 cm hücre kültürü Petri kabı üzerine plaka hücre süspansiyonu (bkz. adım 3.1.1 ve 3.1.2). 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Ardından, nazik pipetleme ile yapışmayan hücreleri toplayın.
- Toplanan hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgeci ile 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 10 mL farklılaşma ortamında [5 ng / mL insan kök hücre faktörü (hSCF) ile OP9 ortamı, 5 ng / mL insan Flt3 ligandı (hFLT3L) ve 5 ng / mL insan interlökin 7 (hIL-7)] içinde yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu yeni bir 10 cm OP9/DLL1 birleşik tabağa yerleştirin.
- 16. günde, hücreleri geçin.
- Yapışmayan hücreleri nazik pipetleme ile mekanik olarak ayırın ve 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 10 mL farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu yeni bir 10 cm OP9/DLL1 birleşik tabağa yerleştirin.
- Daha sonra her 5-7 günde bir, adım 3.8'i tekrarlayarak yapışmayan hücreleri geçirmeye devam edin.
- 35. günde, CD4 + CD8 + çift pozitif (DP) popülasyonu zenginleştirin ve CD8αβ + tek pozitif (SP) T hücreleri üretmeye teşvik edin (Şekil 2).
- Topakları çıkarmak için 100 μm'lik bir hücre süzgecinden nazikçe pipetleyerek ve filtreleyerek yapışmayan hücreleri mekanik olarak ayırın. CD4 + hücre popülasyonunu, üreticinin protokolüne göre CD4 manyetik boncuk izolasyonu ile zenginleştirin.
not: CD4 manyetik boncukların kullanılmasının mantığı, CD4-CD8-çift negatif (DN) hücrelerin kültürden çıkarılmasıdır, çünkü bunların stimülasyondan sonra CD4 + CD8 + DP hücrelerinin doğrudan öldürülmesine neden olduğu gösterilmiştir.
- Bir Neubauer hemositometresi ve Tripan mavisi boyası kullanarak canlı CD4 ile zenginleştirilmiş hücreleri sayın. OP9 ortamında toplam 0.5 x 106 hücre / mL konsantrasyonda süspansiyon edin. Bir doku kültürü düz tabanlı 24 sağlıklı OP9 / DLL1 plakasının her bir oyuğuna 1 mL hücre süspansiyonu (0.5 x10, 6 hücre) alikot.
- 100 IU insan interlökin 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anti-insan CD3 antikoru ve 2 μg/mL anti-insan CD28 antikoru ekleyin, ardından 37 ° C'de kültürleyin.
