$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dilim Hazırlama
- Bir dilim geri kazanım odası oluşturun veya elde edin.
NOT: Bir geri kazanım odasının prensibi basittir ve laboratuvarda yapılabilir (Şekil 1). Kısaca oda, beyin dilimlerini yapay beyin omurilik sıvısının (aCSF) yüzeyinden daha düşük bir seviyede tutmak için bir sepetin yerleştirildiği bir haznedir.
- Örnek olarak, dört halka (4 - 6 mm yüksekliğinde) elde edin (Şekil 1A, yandan görünüm; B, üstten görünüm) 30 cc'lik bir şırınga keserek. Daha sonra, beyin dilimlerini tutmak için gerilmiş ağları (örneğin naylon bir hortumdan kesilmiş) halkaların bir tarafına yapıştırın (Şekil 1B) ve halkaları birbirine yapıştırın.
NOT: Tutkal tabancası kullanılabilir.
- Dört halka yapıştırıldıktan sonra, oksijen kabarcıklarını iyileşen beyin dilimlerinden yönlendirmek için halkalardan ikisine (Şekil 1A ve B) kavisli ikizkenar yamuk şeklinde plastik bir duvar yapıştırın (Şekil 1C ve D). Şekil 1D'de gösterildiği gibi, plastik duvarlarla aynı tarafa bir oksijen yayma sistemi (burada bir gaz dağıtma tüpü) yerleştirin.
- Dilimlemeden önce oksijenlendirin (%95 O2/5% CO2) ve dilimleme solüsyonunu (bkz. adım 1.4) 0 - 2 °C'ye soğutun.
- Özel geri kazanım odasını oda sıcaklığında (RT) standart aCSF ile doldurun. Geri kazanım odasına dilimleri yerleştirmeden önce aCSF'nin iyi oksijenlendiğinden emin olun (20 - 30 dakika, süre hazne hacmine göre değişebilir). Gaz kabarcıklarının dilimlerle doğrudan temas etmediğinden veya dilimleri bozmadığından emin olun.
- Vibratomlu buz tepsisini buzla kaplayın ve dilimleme haznesinin üçte biri ila yarısı suya batırılacak şekilde soğuk suyla doldurun. Dilimleme haznesine bir oksijen dağıtım sistemi (örn. gaz yayma taşı) ve bir sıcaklık probunu dikkatlice yerleştirin, böylece hiçbir öğe bıçak hareketine veya dilim manipülasyonuna müdahale etmez.
- Beynin çıkarılması ve istenen beyin bölgesinin diseksiyonu için gerekli diseksiyon alanını ve araçlarını hazırlayın.
NOT: Farklı beyin yapıları farklı düzlemlerde (örneğin, koronal, sagital veya yatay dilimler) dilimleme gerektireceğinden, gerçekleştirilen kesin diseksiyon, incelenen spesifik beyin bölgesine bağlı olacaktır.
- Aşağıdaki aletleri bir alt ped üzerine yerleştirin: kafa kesme makası, neşter, küçük düz keskin uçlu makas, damar kanülasyon forsepsleri (veya sıçan kafatasları için daha uygun olan rongeurs gibi geniş uçlu herhangi bir cerrahi alet), kavisli hemostatik forseps, cımbız, spatula, kepçe spatula, filtre kağıdı, Petri kabı, tek kenarlı tıraş bıçağı ve siyanoakrilat yapıştırıcı.
- Sıcaklık 0-2°C'ye ulaştığında, dilimleme solüsyonunu dilimleme odasına (tampon tepsisi) aktarın.
- Fareyi izofluran kullanarak bir kurutma odasında uyuşturun. Kesin miktar, kullanılan haznenin boyutuna göre değişebilir, ancak küçük bir ayakkabı kutusu kafesi için birkaç damla (~ 3-4) kullanın. Fareyi hareketsiz hale gelene kadar kafeste bırakın (dokunsal uyaranlara yanıt vermeden; burada açıklanan koşullar için yaklaşık 15 saniye). Hayvanın derinlemesine anestezi uygulandığından emin olmak için kuyruk ve ayak çimdikleme testleri yapın, ardından kalp atmayı bırakmadan önce başını kesin (hücre canlılığını artırır).
NOT: Uygun bir gerekçeyle, bazı laboratuvarlar mümkün olduğunca eksitotoksik süreçleri en aza indirmek ve hücre canlılığını artırmak için canlı dekapitasyon yapma yetkisi alır.
- Diseksiyonu gerçekleştirin.
NOT: Beyin hızlı bir şekilde çıkarılmalıdır (<45 saniye).
- Neşter kullanarak, kafatasının üstündeki yüzeysel cildi rostraldan kaudal olarak kesin.
- Başın her iki tarafındaki kafa derisini soyun.
- Küçük düz keskin uçlu makas kullanarak, beyinciği çıkarmak için lambdoid sütür boyunca interparietal plakayı kesin. Oksipital kemiği çıkarın.
- Aynı makası kullanarak sagital sütürü kesin.
- Damar kanülasyon forsepslerini (veya bir sıçan kafatasını kırıyorsanız rongeurs) her parietal kemiğin altına kaydırın ve beyni açığa çıkarmak için çekin.
- Kavisli hemostatik forsepsleri kullanarak, onları kırmak için ön kemikleri sıkıştırın, ardından kırık kemikleri çıkarmak için cımbız veya damar kanülasyon forsepsleri kullanın. Diseksiyonu engelleyebileceğinden, dura materini mümkün olduğunca nazikçe kesin ve çıkarın.
- Spatulayı beynin altına kaydırın ve yavaşça kafatasından dışarı çekin. Daha önce buz gibi soğuk aCSF ile doldurulmuş dilimleme haznesine (tampon tepsisi) yerleştirin. Beynin 1-2 dakika soğumasını bekleyin.
- Daha fazla yüzey teması sağlamak için bir Petri kabını buz ve biraz buzlu su ile doldurarak diseksiyon platformunu hazırlayın. Çanağı kapağıyla örtün ve üzerine filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdını soğuk aCSF ile ıslatın.
- Beyin soğuduktan sonra, beyni buz dolu petri kabına yerleştirin ve istenen dilimleme düzlemini elde etmek için uygun diseksiyonu hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
- Nucleus accumbens (NAc) içeren sagital dilimler elde etmek için, koku alma tüberküllerini ve hala mevcutsa beyinciği kesmek ve çıkarmak için tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın. Ardından, numune tutma plakasına yapıştırılacak düz yüzeyi elde etmek için sağ hemisferin yan sınırından 2-3 mm'lik bir sagital kesim yapın (bkz. adım 1.8.11).
NOT: Yarım kürenin yan sınırından sadece 2 - 3 mm kesmek, her iki yarım küreden NAc içeren dilimlerin toplanmasına izin verecektir. Uygun diseksiyon, araştırılan beyin bölgesine bağlı olacaktır. Burada, NAc nöronlarının sagital beyin dilimlerinde kaydedilebilmesi için diseksiyon yapılır.
- Beynin düz kesilmiş yüzeyini istenen dilimleme düzlemine göre plaka üzerine hızlı bir şekilde yapıştırın (numune tutma plakasına uygulanan siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak). Sagital beyin dilimleri elde etmek için adım 1.8.10'a bakın.
- Numune tutma plakasını hemen dilimleme haznesine yerleştirin ve sabitleyin, böylece beyin rostro-kaudally olarak dilimlenir (güvenlik için, bıçak tutucuyu yalnızca numune plakası sabitlendiğinde ayarlayın).
- Vibratomu uygun dilimleme parametreleriyle ayarlayın (Malzemeler'de belirtilen vibratom için laboratuvarda kullanılan parametreler: hız 3 - 4, titreşim 9-10 ve dilim kalınlığı 250 μm).
- Dilimleme sonrasında, beyin dilimlerini kurtarma odasına (RT'de) aktarmak için plastik kesilmiş bir transfer pipeti kullanın (bkz. adım 1.3). İyileşme süresi, incelenen nöronal tipe bağlı olarak değişebilir (tipik olarak 30 - 90 dakika).
2. Mikropipetlerin Kaydedilmesi ve Teçhizat Hazırlığı
- İstenen mikropipet özelliklerini elde etmek için çektirme kullanım kılavuzundaki özel yönergelere bakın.
NOT: MSN'ler için 3,2-4,0 MΩ'luk bir pipet direnci aralığı kullanıyoruz.
- aCSF'yi oksijenlendirin ve akışı 2 ml/dk'ya ayarlayın. Tesise monte edilmiş peristaltik bir pompa veya vakum hatları kullanarak aCSF'yi vakumlayın.
- İstenen sıcaklığı (örn. 31.8-32.2 °C) elde etmek için perfüzyon ısıtıcı kontrolörünü açın ve sıcaklık ayarlarını yapın.
NOT: Sıcaklık kararlılığı, haznede hem sabit bir aCSF seviyesine hem de sabit akış hızına sahip olmaya bağlıdır. Nöronların çeşitli biyofiziksel özellikleri (örneğin, giriş direnci, Ri, aynı zamanda membran direnci, Rm olarak da adlandırılır) sıcaklığa duyarlı olduğundan, sabit bir sıcaklığın korunması önemlidir.
- Bilgisayar kontrollü amplifikatörü, kamerayı, mikromanipülatörü ve mikroskop arka plan ışığını açın. Dokunun elektriksel stimülasyonunu gerektiren bir deney yapıyorsanız, uyaran denetleyicisini ve izolasyon ünitesini açın.
NOT: Bazı amplifikatörler diğer üreticilerden önce bir "ısınma" önerir, bu nedenle tam çalıştırma prosedürü için kılavuza başvurmanız önerilir.
- Kamera yakalamayı, sinyal toplamayı ve amplifikatör yazılımını başlatın.
- Dilim Yerleştirme ve Görselleştirme:
- Plastik, kesilmiş uçlu bir transfer pipeti kullanarak, kurtarma odasından bir beyin dilimini nazikçe çekin.
- Transfer pipetini kayıt haznesine yerleştirin ve pipetten dilimi haznenin alt kısmını kaplayan lamel üzerine nazikçe sıkın.
NOT: Taşma meydana gelmediği sürece, geri kazanım odasından bir miktar aCSF'nin banyoya dökülmesi zararsızdır.
- Dilimin konumunu değiştirmek için forseps kullanın, böylece istenen alan tam olarak kayıt odasının ortasına yerleştirilecektir. Konumlandırmada yardım için mikroskobu, düşük güçlü (4X) objektif lensi ve göz merceğini kullanın.
- İstenilen pozisyon elde edildikten sonra, beyin dilimi pozisyonunu haznede bir dilim tutma ("arp" olarak da bilinir) ile sabitleyin.
- Yüksek güçlü (40X) objektif merceğine geçin ve haznedeki aCSF ile temas oluşana kadar yavaşça indirin.
- Dokuyu odaklamak için ince ayar çarkını kullanın. aCSF ile temas halindeyken, mikroskop üzerindeki kaba ayar çarkını kullanmayın, çünkü objektif merceğini aşırı derecede indirmek dilimi ezebilir ve hatta haznenin tabanını kaplayan kapak kızağını kırabilir, bu da aCSF'nin kondansatörün üzerine dökülmesine ve ona zarar vermesine neden olabilir.
- Odak doku seviyesinde olduğunda, şekil için hedeflenen bölgedeki hücreleri gözlemleyin. Ölü hücreler, şişmiş plazma zarı ve çekirdeği ile kolayca tanımlanabilir (Şekil 1E). Sağlıklı hücreler yuvarlak, oval veya eliptik homojen yapılar olarak görünmelidir (Şekil 1E).
- Bir hedef hücre arayın. Kayıt mikropipetini yönlendirmeye yardımcı olması için bilgisayar ekranında işaretleyin. QCapture gibi bir yazılım kullanıyorsanız, farenin sol tıklamasını basılı tutarak hedef hücrenin etrafına bir kare çizin.
- Objektif merceği, objektif merceğinin aCSF ile temas halinde olmasının oluşturduğu koni içinde kayıt mikropipetini yerleştirmek ve hareket ettirmek için yeterli boşluk kalacak şekilde kaldırın.
- Mikropipet Yerleştirme ve Konumlandırma
- 1 ml'lik bir şırınga, metalik olmayan bir mikroşırınga iğnesi ve özel bir filtre kullanarak, bir mikropipeti planlanan deneye göre önceden hazırlanmış dahili solüsyonla doldurun (K+ bazlı veya Cs + bazlı dahili solüsyon, bkz. Dahili çözeltinin mikropipet tutucu içindeki klorür kaplı gümüş tel elektrot ile temas etmesi için yeterli miktarda çözelti kullanın.
NOT: Gümüş tel elektrot, ev tipi çamaşır suyuna batırılarak klorlanabilir. Nükleosit trifosfatlar (adenozin trifosfat, ATP ve guanozin trifosfat, GTP) kullanımdan önce iç çözeltiye eklenebilir. ATP / GTP bozulmasını önlemek için çözeltiyi içeren şırıngayı buz üzerinde tutun.
- Mikropipette hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü mikropipet doku içindeyken dışarı çıkabilir ve dilimi gizleyebilir.
- Mikropipeti elektrot tutucusuna yerleştirin, böylece çözelti gümüş klorür kaplı tel elektrotla temas eder.
- Pipet kapağını, koni yıkayıcı mikropipetin etrafında bir sızdırmazlık oluşturacak şekilde sıkın.
- Pipete girmesini önlemek için mikropipeti aCSF'ye daldırmadan önce pozitif basınç uygulayın.
- Baş sahnesini kilitli konuma (hazneye bakacak şekilde) yerleştirin ve mikromanipülatörü kullanarak, kabaca daldırılan objektifin merkezinin altında olacak şekilde hazneye doğru aşağı doğru yönlendirin.
- Mikropipeti mikromanipülatörle (orta ila yüksek hıza ayarlanmış) hareket ettirirken, mikropipeti bulmak için bilgisayar ekranını kullanın ve onu XY eksenindeki hücrenin konumuna doğru yönlendirin.
- Clampex yazılımında "Membran Testi" kullanılıyorsa "banyo" modu gibi özel bir yazılım aracılığıyla manuel veya otomatik olarak gerçekleştirilebilen bir voltaj adımı (örn. 100 msn için 4 mV) uygulayarak mikropipet direncini ölçün (ayrıca bkz. adım 4). Mikropipeti tıkayan hava kabarcığı veya başka herhangi bir yabancı cisim olmadığından emin olmak için, polietilen boru ile mikropipet tutucusuna bağlı hava dolu şırıngayı (örn. 30 cc şırınga) kullanarak pozitif basınç uygulayın.
- Mikropipeti temizledikten sonra, pipet akımını sıfıra indirmek için bir voltaj ofseti gerçekleştirin, bu manuel olarak veya bilgisayar kontrollü amplifikatör kumandasındaki 'pipet ofseti' gibi özel bir yazılım aracılığıyla gerçekleştirilebilir.
NOT: Bu işlev, banyo ve mikropipet çözeltileri arasındaki konsantrasyon farklılıklarından (yani sıvı bağlantı potansiyeli) kaynaklanan herhangi bir voltajı telafi edecektir.
3. Membran Testi
NOT: Bu adım, Malzemeler'de bahsedilen amplifikatör için geçerlidir.
- Bilgisayar kontrollü bir amplifikatör kumandası kullanırken, membran testini gerçekleştirmek için her zaman voltaj-clamp moduna ayarlayın.
NOT: Membran testi "Banyo" moduna ayarlandığında, membran testi, conta oluşturulduğunda mikropipet direncinin ve conta direncinin ölçülmesine izin verir.
- Membran yırtıldıktan sonra (bkz. adım 4.8), membran testini "Hücre" moduna getirin, böylece seri direnç (RS) (erişim direnci, Ra olarak da adlandırılır), Ri ve membran kapasitansı (Cp) elde edilebilir.
4. Son Yaklaşım, Mühür Oluşumu ve Tüm Hücre Konfigürasyonunun Elde Edilmesi
- İnce odak tekerleğini kullanarak, mikropipeti kademeli olarak indirirken odaklamaya başlayın. Her zaman önce aşağıya odaklanın ve ardından mikropipeti odak düzlemine indirin. Bu, mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmemesini sağlayacaktır.
- Mikropipet dilimin yüzeyi ile temas ettiğinde, mikromanipülatör hızını orta-düşük moda yavaşlatın.
- Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için pipet tutucuya bağlı hava dolu şırınga ile hafifçe hafif pozitif basınç uygulayın.
- Hücreye ya XYZ kontrol düğmeleri ile dönüşümlü olarak ya da çapraz olarak yaklaşarak (mikromanipülatör modeli izin veriyorsa) her iki XZ ekseninin Z ekseni düğmesinin dönüşüyle değiştirildiği yerde yaklaşın. İkinci yöntem, dokunun dikey olarak sıkışmasını önleyecektir.
NOT: Burada amaç dilime en az zarar vererek hücreye yaklaşmaktır. Mikropipet hücreye yeterince yakın olduğunda, bir çukur ortaya çıkar (mikropipetin ucundan uygulanan pozitif basıncın neden olduğu hücre yüzeyinde yuvarlak bir renk değişikliği) (Şekil 2).
- Çukur göründüğünde (Şekil 2-1), sızdırmazlığı oluşturmak için pipet tutucu emme borusuna bağlı olan borudan zayıf ve kısa bir emme uygulayın (Şekil 2-2). Membran testini izlemeye devam edin.
NOT: Kısmi bir conta oluşursa (<1 GΩ), tutma potansiyelini düşürerek (bilgisayar kontrollü amplifikatör komutanında) negatif akımlar enjekte etmek, conta oluşumunu kolaylaştırabilir ve gigaohm direncine ("gigaohm conta" veya "gigaseal" >1 - 5 GΩ) ulaşabilir. Contanın yüksek direnci (>1 GΩ) hem kaydedilen sinyale gürültü kirlenmesini sınırlayacak hem de yamanın mekanik stabilitesine katkıda bulunacaktır.
- Bir gigaseal oluşurken, zar yırtıldıktan sonra ani değişiklikleri önlemek için hücrenin tutma potansiyelini fizyolojik dinlenme potansiyeline (Vdinlenme) mümkün olduğunca yaklaştırmak için bilgisayar kontrollü amplifikatör kumandasını kullanın. Örneğin, MSN'ler genellikle -70 veya -80 mV'de (fizyolojik Vdinlenme: -70 ila -90 mV) voltajla sıkıştırılır.
- Gigaseal oluştuktan sonra, hızlı ve yavaş kapasitansı manuel veya otomatik olarak telafi edin. Bilgisayar kontrollü bir amplifikatör kullanıyorsanız Multiclamp kumandası gibi, 'Cp Hızlı' ve 'Cp Yavaş' için 'Otomatik'e basın.
- Conta stabil kalırsa ve 1 GΩ'un üzerindeyse (veya hücreyi istenen zar potansiyelinde tutmak için 10 - 20 pA'dan daha az enjekte edilirse), plazma zarını yırtmak için 4.5'teki gibi aynı tüpten kısa ve güçlü bir emme uygulayın (Şekil 2-3).
NOT: Bu işlem birkaç deneme gerektirebilir. İyi bir membran yırtılması, yırtılmış membranın mikropipeti tıkamaması (kayıt sırasındaR'lerde bir artışa neden olabilir) için yeterince güçlü bir şekilde emme yapıldığında elde edilir, ancak zarın veya hücrenin büyük bir bölümünü çekmemek için yeterince zayıftır.
- Başarılı bir tam hücre konfigürasyonu elde ettikten sonra, yama kaybına yol açabileceğinden, önemli sapmayı değerlendirmek ve düzeltmek için mikropipet konumunu düzenli olarak izleyin. Sapma genliği, teçhizat kurulumunun kalitesi ve kafa sahnesindeki çekme kuvvetleri gibi çeşitli faktörlere göre değişebilir. İdeal olarak, sürüklenme neredeyse hiç olmamalıdır.
- Membran testinde "Hücre" moduna geçerek, hücrenin Ri, Rs ve Cp gibi farklı parametrelerini görüntüleyin. Kayıt sırasında bu parametreleri izleyin.
NOT: Tüm bu parametreler, hücrelerin ve hücre tiplerinin başlangıçtaki sağlık durumunu değerlendirmeye yardımcı olabilir ("Membran testi" bölümüne bakınız, adım 4).
