$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çözeltilerin Hazırlanması
- Standart yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF; Tablo 1)
- Taze bir çözelti hazırlamak için daha önce çift damıtılmış su ile durulanmış yüksek saflıkta tuzlar ve temiz cam kaplar kullanın. Tüm hücre dışı ve hücre içi çözeltilerin hazırlanması için yüksek kaliteli çift damıtılmış su kullanın.
- Tablo 1'e göre, NaHCO3'ü 500 mL suda çözmek için 2 L'lik bir beher ve iki değerlikli iyonların çökelmesini önlemek için diğer tuzları çözmek için başka bir beher alın. Spatulayı çift damıtılmış su ile sistematik olarak temizleyin ve tuz almadan önce kurulayın. Çözünmeyi homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı kullanın. Her iki beherdeki çözeltileri uygun bir hacimsel şişeye ekleyin ve uygun hacme getirin.
- Nihai hücre dışı çözeltinin tamamen şeffaf olduğundan ve herhangi bir yağış izi olmadığından emin olun.
- Dilimleri perfüze etmeden 20 - 30 dakika önce %95O2 ve %5 CO2'den (karbojen gazı) oluşan bir gaz karışımını bir cam mikrofiltre mum (Ø 13 mm) ile uygulayın. ACSF'nin ozmolaritesini (2 - 3 ardışık ölçüm) bir ozmometre (optimum aralık: 314 - 325 mOsmol/L) ile dikkatlice kontrol edin. Hazırlandıktan sonra kalan çözeltiyi 4 °C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
- Kesme çözeltisi (sakaroz-ACSF; Tablo 2)
- 3 L taze çözelti hazırlayın. Bir hayvandan beyin dilimleri hazırlamak için 1 L kullanın. Kalan çözeltiyi 4 °C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
NOT: Sinaptik iletimi azaltmak için yüksek Mg2 + ve düşük Ca2 + konsantrasyonları kullanılır ve dokuyu korumak için bir miktar NaCl sükroz ile ikame edilir.
- Hücre içi çözümler
- Çift tam hücre kayıtları için önceden 100 mL çözelti hazırlayın (Tablo 3).
- Hücre morfolojisinin iyi bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için metilsülfat ekleyin. Daha sonra nöronun morfolojisini incelemek için biyosit (% 0.1 - 0.4) ekleyin. Kayıt sırasında dendritlerin uzamasını takip etmek için bir floresan boya (örneğin, Alexa 594 veya Sulforhodamine 101 41) ekleyin (isteğe bağlı).
- Hücreye bağlı kayıtlar için önceden 100 mL elektrot çözeltisi hazırlayın (Tablo 4). Bu durumda, dahili çözüm, makroskopik hiperpolarizasyonla aktive edilen katyon akımını (I, h) izole etmek için tasarlanmış bir yüksek K+ çözeltisidir ve diğer voltaj kapılı iyon kanalları için blokerler içerir.
- Hücre içi solüsyonları -20 ° C'de 2 mL alikotlarda saklayın. Her yeni kayıt oturumu için yeni bir alikot kullanın. Çözülen her alikotun ozmolaritesini bir ozmometre ile dikkatlice kontrol edin. Ozmolarite başlangıç değerine karşılık gelmiyorsa yeni bir alikot alın.
- Çözeltiyi alikottan 3 mL'lik bir şırıngaya aktarın, bunun üzerine 0.22 μm'lik bir steril şırınga filtresi yerleştirilir. Bileşiklerinin (ATP, GTP veya fosfokreatin) bozulmasını sınırlamak için kayıt oturumu sırasında şırıngayı buz üzerinde tutun.
2. Yama Pipetinin İmalatı ve Dolumu
- Çek -erek
- Yatay bir elektrot çektirmesi ve kalın duvarlı borosilikat cam boru kullanın. Tüm hücre ve hücreye bağlı kayıtlar için 2 mm dış çap/1 mm iç çap kullanın. Cam borunun kesinlikle temiz olduğundan emin olun.
- Aksi takdirde, cam kılcal damarları önce organik bir çözücüye (örneğin etanol) ve ardından çift damıtılmış suya batırın. Kılcal uçları bir Bunsen brülörü ile kısaca ısıtın. Alternatif olarak, yıkanmış ve ısıtılmış cam boruları doğrudan üreticiden sipariş edin (Malzeme listesine bakın).
- İkili somatodendritik kayıtlar için, hücre içi çözelti ile doldurulduğunda somatik pipet direncinin 6 ila 10 MΩ arasında ve dendritik pipetler için 8 ila 19 MΩ arasında olduğundan emin olun (Tablo 3). Nöronun somatodendritik alanı boyunca karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için hücreye bağlı kayıtlar için pipet direncini 10 MΩ'luk bir dirence standartlaştırın.
- Her kayıt seansından önce (her gün) veya yama uygulamadan hemen önce yeni pipetler hazırlayın ve üretimlerinden 5 - 8 saat sonra kullanın. Pipetleri tozdan ve ucun tıkanmasından korumak için kapalı bir cam kapta saklayın.
- Parlatma
- Membran ile daha iyi sızdırmazlık elde etmek için her pipet ucunu bir microforge ile inceleyin ve ısıyla parlatın. Microforge'u kullanmadan önce, platin ısıtma filamenti üzerinde küçük bir cam parçasını eritin. Sabitlik için platin filament üzerindeki bu cam kaplamayı günlük olarak değiştirin (Peter Jonas, kişisel iletişim).
not: Hücreye bağlı kayıtlar için kullanılan pipetler, arka plan gürültüsünü azaltmak için ısıyla parlatma adımından önce kaplanabilir. Pipetleri kaplamak için erimiş diş mumu veya silikon elastomer gibi bir yalıtım maddesi kullanılabilir.
3. Beyin Dilimlerinin Hazırlanması
- 16 - 19 günlük sağlıklı Wistar sıçanları kullanın. Sağlıksız hayvanları veya hipotermi veya dehidrasyondan muzdarip hayvanları kullanmayın. Dilimlerin hazırlanmasına başlamadan önce, hayvanı güvenli ve sessiz bir yerde saklayın. Bir hayvanı hazırlarken odada başka bir hayvan bulundurmaktan kaçının. Hayvanları nazikçe manipüle edin.
- Sükroz-ACSF'yi iki adet 400 mL polipropilen (PP) kabın içine dökün ve -80 °C dondurucuda 45 dakika bekletin. Homojen bir buz gibi soğuk sıvı/donmuş çözelti elde etmek için çözeltiyi karıştırın ve beherleri buzun üzerine yerleştirin. Her PP beherinde bir mikrofiltre mumu (Ø 13 mm) kullanarak sakaroz-ACSF çözeltisini karbojen gazı ile besleyin.
- Dilimleyiciyi ve yedek hazneyi hazırlayın
- Yüzeysel dilim katmanlarına verilen zararı mümkün olduğunca en aza indirmek için son derece düşük dikey titreşimlere sahip yüksek kaliteli bir doku dilimleyici kullanın. Dilimleyiciye yeni ve bütün bir tıraş bıçağı sabitleyin.
- Her kesme seansı için yeni bir tıraş bıçağı kullanın. Tıraş bıçağını bükmekten kaçının. Tıraş bıçağının yüzeyindeki yağlı filmi çıkarmayın (Josef Bischofberger, kişisel iletişim).
- Varsa, dikey titreşimi üretici tarafından sağlanan bir vibroprob ile kontrol edin. Alternatif olarak, özel yapım bir vibroprob kullanın. Bıçağın dikey titreşimlerini 0 μm'ye mümkün olduğunca yakın olacak şekilde azaltın.
- Dilimler için 150 mL'lik bir yedek oda hazırlayın. Standart ACSF'yi yedek hazneye dökün ve bir su banyosuna yerleştirin. Yedek hazne çözeltisini bir mikrofiltre mumu (Ø 6 mm) kullanarak karbojen ile besleyin. Karbojen kabarcıklarının mümkün olduğunca küçük olduğundan emin olun.
not: Dilim kalitesini sabit tutmak için her 2-3 ayda bir yeni bir yedek hazne inşa edin.
- Dilimleri kes
- Deneycinin rahatsız edilmediği veya strese girmediği sessiz bir odada, hayvanı servikal medulla seviyesinde ameliyat makasıyla (uzunluk 150 mm) kesin.
- Hayvanın başının üst kısmındaki deriyi bir neşter ile nazal yönde kaudal yönde kesin ve yanal olarak çıkarın. Kafatasının üst kısmını kaudaldan başın burun kısmına kadar ince bir makasla kesin ve kafatasının her iki kısmını da yanlamasına çıkarın. Beyni ince bir spatula ile çıkarın ve dikkatlice karbojen ile dengelenmiş buz gibi soğuk (0 - 4 °C) sakaroz-ACSF içeren bir PP behere bırakın.
not: Bu adım dizisinin mümkün olduğunca çabuk, ancak aynı zamanda titizlikle yapılması gerekir (<<1 dakika, yaklaşık 40 saniye).
- Beyni PP kabının çözeltisinde ~ 2 ila 5 dakika tutun. Beyin hareketlerini önlemek için karbojen basıncını ayarlayın. Karbojen kabarcıkları çok büyükse, mikrofiltre mumunu yenisiyle değiştirin.
- Beyni, iç tabanı ~ 0,5 cm kalınlığında bir Sylgard tabakası ile kaplı 9 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Bu petri kabını önceden hazırlayın.
- Beyni buz gibi sükroz-ACSF ile çevreleyin. ACSF-sükroz çözeltisinin bir miktar sıvı fazının beyni batırdığından emin olun. Koronal dilimler için, koronal düzlemde beynin ön kısmını bir neşter veya tıraş bıçağı ile kesin. Beyincik'i koronal bir kesim ile çıkarın.
- Numune tepsisine siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın (alan ~ 1 cm2). Beyin bloğunu, ön kısım dilimleme aşamasına bakacak şekilde yapıştırın. Bir cam Pasteur pipetinin geniş açıklığını kullanarak yapıştırılan beynin üzerine dikkatlice sakaroz-ACSF damlatın ve ardından dilimleyicinin kesme haznesini yavaşça daldırın. Numune tepsisini, kesme yüzeyi (yani bıçağa ilk çarpan doku) beynin ventral yüzeyi olacak şekilde hareket
ettirin.
- Kesme haznesine (isteğe bağlı) bükülmüş bir cam mikrofiltre mumu (Ø 6 mm) ile karbojen uygulayın.
- Tıraş bıçağını yatay düzleme göre ~15°'lik bir açıyla ayarlayın. Substantia nigra'ya ulaşmadan önce kaudalden nazal yöne ~ 500 μm'lik koronal beyin dilimleri kesin. İlgilenilen bölgeyi içeren 300 - 350 μm kalınlığında dilimler kesmek için kalınlığı azaltın.
- Tıraş bıçağının kenarına paralel bir şırıngaya bağlı çok ince bir perfüzyon iğnesi ile doku bloğundan dilimler ayırın. İğneyi, iğne ile şırınga arasında 90°'lik bir açı olacak şekilde bükün. Dilimi doku bloğundan çıkarırken tıraş bıçağına herhangi bir baskı uygulanmadığından emin olun.
- Dilimleri saklayın
- Bir cam Pasteur pipetinin (bir ampule bağlı) en büyük açıklığını kullanarak dilimleri yedek hazneye aktarın. Tüm dilimler rezerv odasına aktarıldıktan sonra (Christoph Schmidt-Hieber, kişisel iletişim) su banyosunun sıcaklığını 0,5 - 1 saat boyunca 34 ° C'ye getirin.
- Bu süreden sonra su banyosunu kapatın ve dilimleri oda sıcaklığında tutun. Yedek haznedeki dilimlerin hareket etmesini önlemek için karbojen basıncını ayarlayın. Kayıtlara başlamadan önce dilimleri 10 ila 20 dakika daha saklayın.
- Dilimleme işleminin sonunda ekipmanı ve mikrofiltre mumlarını çift damıtılmış su ile dikkatli ama kapsamlı bir şekilde temizleyin.
4. Nigral Nöronlarda İkili Somatik ve Somatodendrik Kayıtlar ve Biyosit Dosyalaması
- The Axon Guide'da verilen dilimler için bir yama-kelepçe kurulumunun montajı için açıklamaları izleyin.
- Kayıt odasını hazırlayın
- Kayıt odasına 1 - 2 mL çift damıtılmış su koyun. Sızıntı olmadığını doğrulayın. Kayıt odasını değişen xy tablosunun üzerine yerleştirin.
- Standart ACSF'yi oksijen geçirimsiz bir perfüzyon tüp sistemi (politetrafloroetilen) aracılığıyla kayıt odasına besleyin. Odadaki perfüzyon akışını 4 - 5 mL min-1 oranında stabilize edin. ACSF içeren beheri ve kayıt odasını birleştiren borunun uzunluğunu mümkün olduğunca kısa tutun (1 m).
- Yedek hazneden bir beyin dilimi seçin ve bir cam Pasteur pipetinin en büyük açıklığını kullanarak kayıt haznesine aktarın. Dilimi kayıt odasının altına sabitlemek için platin bir halka ile örtün. Düz bir platin halka (Ø 1,5 cm) kullanın ve üzerine paralel naylon iplikler (>2 mm aralıklı) yapıştırın.
- Optikleri ayarlayın ve optimize edin
- Kızılötesi (IR) video mikroskobu kullanarak dilimleri görselleştirin. Köhler aydınlatmasını 51 ayarlayın ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) optiklerini veya eğik aydınlatmayı (Dodt Gradyan kontrastı - DGC) optimize edin.
- Dilimin kalitesini kontrol edin. Yalnızca çok güçlü kontrast oluşturmayan ve yalnızca küçük, dağınık kraterlere sahip pürüzsüz ve düz yüzeylere sahip dilimleri saklayın.
- 2 taze ve kullanılmamış yama pipetini hücre içi solüsyonla doldurun (Tablo 3). Pipetin ucunu kılcallık hareketiyle doldurmak için pipet solüsyonunu içeren 0,5 mL'lik bir tüp kullanın. Filamentsiz pipetlerin uç dolumunu hızlandırmak için, bir şırıngaya bağlı hortumu kullanarak pipetin ucuna negatif basınç uygulayın.
- Pipetleri dilimin yüzeyinin üzerine yerleştirin
- Gümüş teller üzerinde klorür kaplamanın varlığını kontrol edin.
- Pipetleri sırayla pipet tutuculara yerleştirin ve pipet tutucuyu, üç yollu musluğu ve manometreyi bağlayan bir boru devresi kullanarak pozitif basınç (~70 mbar) uygulayın. Pipeti kayıt odasının banyosuna indirin.
- Manometre üzerindeki basınç değerinin ~1 - 2 dk boyunca sabit olduğunu kontrol edin. Basınç düşüyorsa, pipet tutucunun içindeki hortumu veya sızdırmazlık O-ringlerini kontrol edin.
- Pipet ucunu video monitörünün ortasına yerleştirin ve engellenmediğinden emin olun. Pipete basınç uygularken veya bırakırken pipet ucunun hareket etmediğinden emin olun.
- Monitörün ortasına tam olarak pipet ucunun konumunda küçük bir çarpı işareti çizerek pipet ucunun kaymasını ve titreşimini kontrol edin ve ucun olası hareketlerini 5 dakika boyunca gözlemleyin.
- Bir osiloskopta pipet direncini izlemek için bir voltaj adımı (5 mV) uygulayın. Yama kelepçesinin tutma potansiyelini ayarlayın amplifier 0 mV'a. Pipet ofset potansiyelini, DC pipet akımı amplifikatör ölçerde sıfır okuyacak şekilde iptal edin.
- Pipetleri dilime doğru hareket ettirin ve yüzeyin üzerinde tutun.
- Uzun dendritleri olan bir nöronu seçin ve yamalayın
- Substantia nigra içinde, IR-Dodt Gradyan Kontrastı (IR-DGC) kullanılarak yaklaşık olarak aynı düzlemde (Şekil 1A ve 1B) uzun bir mesafe boyunca takip edilebilen uzun dendritlere sahip sağlıklı bir nöron seçin. Pürüzsüz ve homojen bir hücre gövdesi seçin. Dilimin yüzeyindeki iki güçlü kontrastlı hücreden kaçının (Şekil 1C ve 1D), çünkü zaman içinde kararlı kayıt koşullarını korumak ve kırmak zordur (kararlı seri direnci). Somaları dilim yüzeyinin altında 10 - 30 μm olan nöronları seçin.
- Somatik elektrodu soma'ya (40 - 50 μm uzaklıkta) ve dendritik elektrodu dendrite yakın bir mesafede hareket ettirin. Bir dendritin bir kısmını seçmek ve yamalamak için 2X büyütme (dört kat değiştirici) kullanın. Monitörde büyütme olmadan 2.100X (1X) ve 2X büyütme ile 5.500X mutlak büyütme elde edin.
- Somatik pipetin basıncını 10 mbar kadar hafifçe serbest bırakın. Gerekirse, hücre yapısının (soma ve dendrit) dilim içinde yer değiştirmesini önlemek için dendritik ve somatik pipet basıncını düzenleyin.
- Küçük bir çukurlaşma görmek için dendritik pipeti zara yakın konumlandırın. Pipet ucundaki basıncı boşaltın ve pipet direncini kontrol ederken dendrite yama yapın. İdeal koşullarda, iyi bir sızdırmazlık elde etmek için sadece çok hafif bir emme yeterlidir.
- Yüksek kazançlı ve az filtrelemeli bir voltaj darbesi 51 ve osiloskop kullanarak mevcut adımın üstünde pipet kapasitans geçici akımlarının genliğini mümkün olduğunca azaltın. Dendritik pipet ile tüm hücre moduna girin.