Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Spontan ve Elektrot Stimülasyonuna Bağlı Aktiviteyi Araştırmak için Elektrofizyolojik Kayıtlar
- Çok elektrotlu dizi (MEA) kültürünü hücre dışı çözelti ile oda sıcaklığında (RT) yıkayın.
- Kontakları bir mendille kurulayın ve MEA'yı MEA kurulumuna monte edin.
not: Montaj sırasında kültürü nemli tutmak için, kültüre küçük bir damla hücre dışı çözelti ekleyin.
- 300 μl hücre dışı çözelti ekleyin ve sistemin stabilize olmasını sağlamak için kayıttan önce 10 dakika bekleyin.
- Yazılımın kaydet/al düğmesine basarak tüm elektrotlardan 2 dakika boyunca spontan aktiviteyi kaydedin ve kayıt elektrotlarını tanımlayın.
- MEA elektrot stimülasyonu: Uygun yazılımda uyaranın genliğini/süresini/şeklini seçin ve art arda birkaç elektrota uygulayın. Spontan aktivite gösterenlere göre elektrotları seçin (adım 1.4'te olduğu gibi). Kalan tüm elektrotlardan kayıt yapın.
- Stimülasyon artefaktını dışlamak için, aynı elektrottan 10 kez uyarın. Kültür 10 defadan en az 8'inde yanıt verirse, elektrot kaynaklı stimülasyon üzerine olumlu bir yanıt olarak kabul edilebilir.
- Arka plan gürültüsünü tanımlamak için, voltaj kapılı sodyum kanallarını bloke etmek ve 2 dakika boyunca kayıt yapmak için kültüre 1 μM konsantrasyonda Tetrodotoksin (TTX) uygulayın. Ani yükselme tespiti (2.1 ve 2.2) gerçekleştirmek için bunu kullanın.
2. Veri analizi
- Uygun yazılımı kullanarak, standart sapmalara dayalı bir dedektör ve müteakip bir ayırıcı kullanarak her elektrot için spontan aktiviteyi tespit edin. Etkinlik, hızlı voltaj geçişleri (<5 msn) olarak görünür.
- TTX ile muamele edilmiş numuneleri analiz ederken hiçbir aktiviteye neden olmayan bir eşik seçin. Yanlış pozitif ve yanlış negatif algılamaları arasında ayrım yapmak için her denemenin eşik değerini uyarlayın.
- Uygun yazılımı kullanarak, her bir elektrotun tespit edilen nöronal aktivitesini standart prosedürlere göre bir raster grafiği olarak gözlemleyin (bkz. Şekil 1A-C).
- Algılanan tüm olayları 10 msn'lik kayan bir pencerede toplayarak ve 1 msn'lik adımlarla kaydırarak toplam ağ etkinliğini belirleyin ve görüntüleyin.
- Uygun analiz yazılımı kullanarak ham verileri görüntüleyerek stimülasyonun neden olduğu aktiviteyi tespit edin. Tek ani artışları çevrimdışı olarak manuel olarak tanımlayın. Tek sivri uçlar, stimülasyon artefaktından sonra meydana gelen hızlı voltaj geçişleri olarak görünür (Şekil 1E'deki ok ucu). Şekil 1E'de bir örnek gösterilmiştir.
- Deneye bağlı olarak, yanıt veren elektrotların sayısını, bir yanıt elde etmek için gereken eşiği, elektrot başına aksiyon potansiyeli sayısını ve diğer ilgili parametreleri analiz edin.
