Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>NOT: Prosedüre dahil olan her katılımcının temel cerrahi prosedürler konusunda uygun şekilde eğitilmiş olması ve hayvan deneyleri yapmak için geçerli bir lisansa sahip olması gerekir.
1. Anestezi ve premedikasyon
- Bir sıçanı intraperitoneal sodyum pentobarbital enjeksiyonları ile uyuşturun (400-400g ağırlığındaki 6 aylık erkek Wistar sıçanları için 60 mg · kg-1 başlangıç dozu).
not: Bu protokol, belirtilen suş, cinsiyet veya sıçanların yaşı ile sınırlı değildir. Ayrıca, ketamin-ksilazin karışımı, alfa-kloraloz veya fentanil+midazolam+medetomidin gibi alternatif anesteziler, farklı araştırma hedefleri için daha uygunsa veya etik kurul tarafından gerekli görüldüğünde kullanılabilir.
- Yaklaşık 5 dakika sonra, sıçanın arka bacak parmağını künt forseps ile sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Protokolün sonraki adımlarına yalnızca herhangi bir refleks eylemi gözlenmediğinde devam edin.
- Entübasyondan sonra mukus üretimini azaltmak için deri altına 0.05 mL atropin enjekte edin.
- % 4 glikoz çözeltisi, NaHCO3 (% 1) ve jelatin (% 14) içeren 5 mL fosfat tamponunu deri altına enjekte edin. Bu tampon, bir deney boyunca deri damarları tarafından emilecek ve sıvı dengesinin korunmasına yardımcı olacaktır.
- Ameliyat boyunca, hayvanı refleks eylemleri açısından periyodik olarak kontrol edin ve gerekirse anesteziyi destekleyin (10 mg · kg-1 · h-1 sodyum pentobarbital).
2. Cerrahi
- Sol arka ayağın sırt kısmına, ayak bileğinden kalçaya, arka tarafa, kuyruktan yüksek torasik (Th) segmentlere, göğsün sol tarafına ve sternumun üzerindeki boyun bölgesinin ventral tarafına kürk tıraş ederek hayvanı cerrahi tedaviye hazırlayın
- İntravenöz hattın yerleştirilmesi
- Fareyi kapalı devre bir ısıtma yastığına sırt üstü yerleştirin (ve uzuv sabitlemeleriyle sabitleyin).
- 21 bıçak kullanarak, sternumdan çeneye kadar deriden uzunlamasına bir kesim yapın.
- Cildi forseps ile tutun ve alttaki dokudan ayırın.
- Künt diseksiyon tekniklerini kullanarak sağ juguler veni ortaya çıkarın. Damarı çevre dokulardan dikkatlice inceleyin.
- Damarın dallanma noktaları olmayan kısmını bulun ve altına iki adet 4-0 ligatür kaydırın.
- Damarın daha önce tanımlanmış dallanmayan segmentinin proksimal ucunda bir gevşek düğüm ve damarın bu segmentinin distal ucunda bir gevşek düğüm yapın. Damarı kalbe proksimalden klempleyin ve ardından damarın distal kısmını bağlayın.
- İris makası kullanarak, kelepçe ile uzak bağ arasında bir kesi yapın. Damarın bir kanadını tutun ve kelepçe tarafından bloke edildiği noktaya önceden doldurulmuş bir kateter sokun.
- Damarı ve kateteri forseps ile bir arada tutarken, kelepçeyi çıkarın ve kateteri damarın içine birkaç milimetre itin. Kateterin her iki ucunu damara sabitleyin ve cilde ek bir sabitleme noktası ekleyin.
3. Trakeal tüpün tanıtımı
- Künt forseps kullanarak, sternohyoid kasları kaplayan iki mandibular bezi ayırın. Trakeayı ortaya çıkarmak için orta hatta sternohyoid kasları ayırın.
- Trakeanın altına üç adet 4-0 ligatür kaydırın, ardından trakeal tüp yerleştirme noktasının altında iki düğüm ve yukarıda bir düğüm yapın.
- Larinksin krikoid kıkırdağını bulun ve üçüncü trakeal kıkırdağın altında bir kesi yapın.
- Trakeaya bir trakeal tüp yerleştirin ve tüpü önceden hazırlanmış ligatürlerle yerine sabitleyin, ardından cilde ek bir ligatür ekleyin.
- Ayrılan kasların üzerine küçük bir parça pamuk yünü yerleştirin ve cildi ameliyat edilen bölgenin üzerine dikin.
4. Arka bacak sinirlerinin diseksiyonu
- 21 bıçak kullanarak, sol arka bacak arka tarafında Aşil tendonundan kalçaya kadar uzunlamasına bir kesim yapın.
- Cildi forseps ile kavrayın ve künt diseksiyon tekniklerini kullanarak, cildi insizyonun her iki tarafındaki alttaki kaslardan ayırın.
- Biceps femoris kası ile kaplı diz ekleminin arkasındaki popliteal fossa'yı bulun ve makas kullanarak bu kasın ön ve arka kısmı arasında bir kesi yapın.
- Yukarı doğru hareket ederek, siyatik siniri ortaya çıkarmak için pazı femorisinin iki başını kalçaya kadar kesin. Kanamayı önlemek için gerektiği gibi koterize edin.
- Siyatik sinirin sural, tibial ve ortak peroneal dallarını tanımlayın.
- Makas kullanarak, tibial siniri ve dallarını ortaya çıkarmak için lateral kısmı gastroknemius kasının medial başından ayırın.
- 55 forseps kullanarak, sural sinirin distal ucunu tutun, distal olarak kesin ve mümkün olduğunca diseksiyon yapın.
- İşlemi ortak peroneal sinir ile tekrarlayın.
- Künt bir cam çubuk kullanarak tibial siniri çevre dokulardan ayırın, kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin ve distal olarak kesin.
- Medial gastroknemius (MG) ve lateral gastroknemius ve soleus (LGS) sinirlerini tanımlayın.
- 55 forseps kullanarak, MG ve LGS sinirlerini dikkatlice inceleyin, onları çevre dokulardan ayırın, ancak ilgili kaslarla olan bağlantılarını koruyun.
- Açıkta kalan sinirlerin altına tuzlu suyla ıslatılmış bir parça pamuk yünü yerleştirin.
- Ameliyat edilen bölgenin üzerindeki cildi kapatın.
5. Laminektomi
- 21 bıçak kullanarak, sakrumdan torasik omurlara kadar uzunlamasına bir kesi yapın.
- Cildi alttaki kaslardan ayırın.
- Torasik ve lomber spinöz süreçlerin her iki tarafındaki longissimus kasını kesin.
- Künt kenarlı bir neşter kullanarak, her omurun enine süreçlerini ortaya çıkarmak için kasları omurgadan geri çekin.
- Künt uçlu makas kullanarak, açıkta kalan omurga boyunca enine süreçlere bağlı kasların tendonlarını kesin. Gerekirse hemostatik ajanlar uygulayın.
- Th13 omurunu kaburga yerleştirme ile en düşük torasik segment olarak tanımlayın ve ince rongeurlar kullanarak, omuriliğin bel segmentlerini ortaya çıkarmak için Th13'ten L2 omurlarına kadar olan spinöz süreçleri ve laminaları çıkarın. Omurga stabilizasyonu için bir sabitleme noktası olarak kullanılacak olan L3 spinöz sürecine zarar vermemeyi unutmayın.
- Th12 spinöz sürecini çıkarın ve omur sırt yüzeyini mümkün olduğunca düzeltin.
- Künt diseksiyon tekniklerini kullanarak, tutucu yerleştirme noktaları oluşturmak için kasları Th11 omurundan ayırın.
- Açıkta kalan omurilik segmentlerinin üzerine ince, tuzlu suya batırılmış pamuk yünü yerleştirin.
- Fareyi, omurgayı desteklemek ve stabilize etmek için iki paralel çubuk ve kelepçeli iki ayarlanabilir kol ile özel yapım metal çerçeveye taşıyın.
6. Kayıt ve stimülasyon için hazırlık
- Vertebral kolon fiksasyonu ve sinir düzenlemesi
- Hayvan vücut sıcaklığını 37 ± 1°C'de tutmak için fareyi kapalı devre ısıtma sistemine bağlı bir ısıtma yastığı üzerindeki özel yapım çerçeveye yerleştirin.
- Elektrokardiyogram (EKG) elektrotlarını derinin altına yerleştirin ve kalp atış hızını izlemek için bir amplifikatöre bağlayın.
- Deri fleplerini kullanarak, açıkta kalan omurilik üzerinde derin bir havuz oluşturun.
- Metal kelepçeler kullanarak, kelepçeleri Th12 enine işlemlerin altına ve L3 spinöz işlemine koyarak vertebral sütunu sabitleyin.
- Vertebral kolonun sabitlendiğinden ve yatay olarak düzenlendiğinden emin olun ve ardından kasları geri çekmek için kolonun her iki tarafına dorso-ventral basınç uygulayın.
- Havuzu ılık (37 °C) mineral yağ ile doldurun ve bu sıcaklıkta tutun.
- Aşil tendonundan 4-0'lık bir bağ geçirin, ameliyat edilen sol arka bacağı kaldırın ve gerin, böylece ayak bileği kalça ile aynı hizada olur.
- Deri fleplerini kullanarak, açıkta kalan tibial, MG ve LGS sinirleri üzerinde derin bir havuz yapın.
- Havuzu ılık (37 °C) mineral yağ ile doldurun.
- MG ve LGS sinirlerini bipolar gümüş telli uyarıcı elektrotlara yerleştirin ve bunları bir kare nabız stimülatörüne bağlayın. Her sinir için ayrı stimülasyon kanalları kullanın.
7. Yüzey elektrot yerleşimi
- Açıkta kalan omuriliğin sol kaudal tarafına, sırt kaslarına yerleştirilmiş bir referans elektrot ile gümüş bir top elektrot yerleştirin ve her iki elektrotu diferansiyel DC amplifikatörüne bağlayın. Yüzey bilyesi elektrodu, sinirlerden gelen afferent voleybolları kaydetmek için kullanılacaktır.
- Sabit akımlı bir stimülatör kullanarak, MG ve LGS sinirlerini 0.1 ms süreli kare darbelerle uyarın, 3 Hz frekansında tekrarlanan ve afferent voleybolları gözlemleyin.
- Sinir aktivasyonu için eşiği (T) belirleyin, her siniri yaklaşık 3·T yoğunluğunda uyarın ve her sinir için afferent voleybolun genliğini kaydedin.
- Yüzey elektrodu rostral hareket ettirin ve her sinir için voleybol genliklerinin en yüksek olduğu omurga segmentlerini belirlemek için prosedürü tekrarlayın. Maksimum voleybol konumunu belirledikten sonra, yüzey elektrodunu omurilikten güvenli bir mesafeye hareket ettirin.
- Kas felci ve solunum hareketlerini azaltmak amacıyla pnömotoraks oluşturulması
- Sıçanı bir nöromüsküler bloker ile intravenöz olarak felç edin ve trakeal tüpü kemirgen uyumlu bir kapnometre ile uyumlu bir harici ventilatöre bağlayın (Pancuronium bromür, 0.4 mg · kg-1 başlangıç dozunda, her 30 dakikada bir 0.2 mg · kg-1 dozlarında desteklenir)
- Gelgit sonu CO2 konsantrasyonunu izleyin ve ventilasyon parametrelerini (frekans, hava basıncı ve akış hacimleri) ayarlayarak yaklaşık% 3\u20124'te tutun.
- Kaydın yan tarafındaki 5. ve 6. kaburga arasındaki deride uzunlamasına bir kesi yapın.
- Künt uçlu makas kullanarak, kaburgalar arasındaki interkostal boşluğu görselleştirmek için üstteki kasları kesin.
- Küçük, keskin makas kullanarak, interkostal kaslarda ve plevrada küçük bir kesi yapın, ardından künt kenarlı bir forsepsin ucunu akciğerlere bastırmamaya dikkat ederek açıklığa sokun
.
- Deney boyunca pnömotoraksı açık tutmak için forsepsin genişlemesine veya küçük bir tüp yerleştirmesine izin verin.
- Nöromüsküler bloktan sonra, EKG frekansını kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin ve kalp atış hızı 400 bpm'yi aşarsa anestezik ajanı destekleyin. Kas felci ve solunum hareketlerini azaltmak için bir pnömotoraks oluşturmak, bu da kayıt stabilitesini artıracaktır.
8. Dura ve pia mater'ın açılması
- #55 forseps kullanarak, dura mater'i yavaşça kaldırın ve L5 segmentinden kaudal olarak, rostral olarak L4 segmentine kadar kesin.
- Bir çift ultra ince 5SF forseps kullanarak, pia'da kan damarları arasındaki dorsal sütunu kaplayan küçük bir yama yapın, tam olarak MG veya LGS sinirinden gelen maksimum afferent voleybol seviyesinde.
- Gerekirse kanamayı engellemek için küçük parçalar halinde tuzlu suya batırılmış ve kurutulmuş jel köpük kullanın.
>9. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) elektrot yerleştirme
- Bir sıçanın karnının ventral tarafındaki deride, lomber (L) 4-L5 omurga segmentlerinin konumuna karşılık gelen rostrokaudal seviyede küçük bir kesi yapın.
- Açıkta kalan cilt flebini, referans elektrot görevi görecek metal bir klipsle tutun.
- Torasik (Th) 12 omurun sırt tarafına tuzlu suya batırılmış bir sünger yerleştirin. Sünger boyutunun aktif bir tsDCS elektrodunun (5 mm çapında daire şeklinde paslanmaz çelik levha) boyutuna eşit olduğundan emin olun.
- İnce bir manipülatör kullanarak, aktif bir tsDCS elektrotlu süngeri kemiğe bastırın ve elektrotun tüm yüzeyinin eşit şekilde bastırıldığından emin olun.
- Referans ve aktif tsDCS elektrotlarını, sürekli bir doğru akım akışı sağlayabilen bir sabit akım stimülatör ünitesine bağlayın.
10. Mikropipetlerin hazırlanması
- Bir mikroelektrot çektirmesi kullanarak bir mikroelektrot hazırlayın.
not: Hem filament hem de filament olmayan elektrotlar kullanılabilir. Bununla birlikte, elektrotun sapının ventral boynuza ulaşacak kadar uzun olması ve inerken omuriliği sıkıştırmayacak kadar ince olması gerektiğini unutmayın.
- Çektirme ayarını, omuriliğe giren şaft yaklaşık 3 mm uzunluğunda olacak, elektrotun ucunun çapı 1\u20122 μm'den fazla olmayacak ve mikroelektrot direnci 10 ila 20 MΩ arasında olacak şekilde ayarlayın.
- Mikroelektrotları 2M potasyum-sitrat elektrolit ile doldurun.
- Hazırlanan mikroelektrodu mikromanipülatöre monte edin, böylece 1\u20122 μm adım hareketi ve stereotaksik kalibrasyona izin verin.
- Mikroelektrodu, sırt kaslarına yerleştirilen referans elektrot ile hücre içi amplifikatöre bağlayın.
- Nöromüsküler bloktan sonra, elektrokardiyogram (EKG) frekansını kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin ve sıçan kalp atış hızı 400 bpm'yi aşmayacak şekilde anestezik ajanı destekleyin.
11. Motonöron takibi ve penetrasyonu
- Afferent voleybol kayıt elektrodunu omuriliğin dorsal yüzeyine, kaudal olarak kayıt bölgesinin bulunduğu yere, L6 segmenti seviyesinde geri yerleştirin.
- Seçilen bir sinir içindeki alfa-motonöronların tüm aksonlarını aktive etmek için medial gastroknemius (MG) ve lateral gastroknemius ve soleus (LGS) sinirlerini 3 Hz frekansında ve 3T yoğunluğunda elektriksel 0.1 ms darbelerle uyarın.
- Mikropipeti, 15\u201220°'lik bir mediolateral açıyla (bir uç yanlara doğru yönlendirilmiş olarak) pia'daki seçili bir yamaya sürün.
- Yüzeyin altına indikten sonra, mikroelektrodu kalibre edin ve kapasitansını ve voltaj ofsetini telafi edin ve tüm parametreler stabil olduğunda omuriliğe nüfuz etmeye devam edin. Motonöron havuzunun bir antidromik alan potansiyeli, ilgili sinirin uyarılması sırasında özel bir motor çekirdeğe yaklaşırken mikroelektrot voltaj izinde görülecektir.
- Mikroelektrot ile penetrasyona 1\u20122 μm'lik adımlarla devam edin ve elektrot ucunu herhangi bir kalıntıdan temizlemek için hücre içi amplifikatörün vızıltı işlevini periyodik olarak kullanın.
- Kaydedilen voltaj izinin ani bir hiperpolarizasyonu ve bir antidromik ani yükselme potansiyelinin ortaya çıkması ile karakterize edilecek olan motonöron penetrasyonunu gözlemleyin.
12. Motonöron membranı ve ateşleme özelliklerinin kaydedilmesi
- Hücre içi amplifikatörün bir köprü modunda, ilgili sinir dallarını uyararak antidromik aksiyon potansiyelinin "ya hep ya hiç" görünümüne dayalı olarak motonöronu tanımlayın. Daha sonra ortalama almak için 20 sonraki izi kaydedin.
- Yüksek kaliteli veri sağlamak için katı bir dahil etme kriteri uygulayın: genlikte en az -50 mV'luk dinlenme membran potansiyeli; pozitif bir aşma ile 50 mV'den büyük aksiyon potansiyeli genlikleri; kayıttan önce en az 5 dakika boyunca stabil membran potansiyeli.
- Hücre içi amplifikatörün süreksiz akım kelepçesi modunda (akım anahtarlama hızı modu 4-8 kHz), 0.5 ms hücre içi depolarize edici akım darbeleri kullanarak bir motonöronda ortodromik bir aksiyon potansiyeli uyandırın. Çevrimdışı ortalama almak için en az 20 kez tekrarlayın.
- Hücre giriş direncini hesaplamak için 40 kısa darbeli (100 ms) hiperpolarize akım (1 nA) ile bir motonöronu uyarın.
- Tek bir sivri uç ortaya çıkarmak için gereken depolarize edici akımın minimum genliği olarak reobaz değerini belirlemek için artan genliklerde 50 ms kare dalga darbeleri olan bir motonöronu uyarın.
- Motonöronların ritmik deşarjlarını uyandırmak için 0.1-2 nA'lık adımlarla artan genliklerde 500 ms kare dalga depolarize edici akım darbeleri enjekte edin.
13. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS)
- Motonöronun stabil bir şekilde penetrasyonunu sürdürürken, doğru akımın trans-spinal uygulamasıyla polarizasyon prosedürünü başlatın. Akım yoğunluğunu ve uygulama süresini deney tasarımına göre ayarlayın (örneğin, 15 dakika boyunca 0,1 mA).
- DC'yi açtıktan hemen sonra, motonöron membran potansiyelini gözlemleyin. Anodal polarizasyon (anot olarak aktif elektrot) membran potansiyelinin depolarizasyonu ile sonuçlanmalı, katodal polarizasyon (katot olarak aktif elektrot) ise zıt bir etki uyandırmalıdır. DC stimülasyonuna yanıt olarak dinlenme membranı potansiyelindeki bir değişikliğin sabit olup olmadığını gözlemleyin, bu da elektriksel alan yoğunluğunun etkilenmemesini sağlar.
- Sürekli akım uygulaması sırasında, 5.3-5.6 adımlarını 5 dakikalık aralıklarla tekrarlayın.
- DC'yi kapatın ve kayıtlar kararsız hale gelene veya dahil etme kriterleri tehlikeye girene kadar 5.3\u20125.6 adımlarını 5 dakikalık aralıklarla tekrarlamaya devam edin.
- Deneyi sonlandırın ve öldürücü dozda pentobarbital sodyumun (180 mg · kg-1) intravenöz uygulamasını kullanarak hayvanı ötenazi yapın.
awy Sp. z o.o