Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği Kullanılarak Medial Vestibüler Çekirdek Nöronlarına Gürültü Akımlarının Uygulanması

Özet

Kaynak: Stefani, S. P., et al. Medial Vestibüler Çekirdek Nöron Duyarlılığının In Vitro Değerlendirilmesi için Stokastik Gürültü Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, gürültü akımlarının elektriksel uyaranlara nöronal duyarlılık üzerindeki etkisini incelemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullanarak eşik altı gürültü akımlarının medial vestibüler çekirdek nöronlarına uygulanmasını içeren bir protokolü göstermektedir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

>1. Hayvanlar

NOT: Fareler, Avustralya Kemirgen Merkezi'nden (ARC; Perth, Avustralya) ve Sidney Üniversitesi'ndeki Tıp Vakfı Binası Hayvan Tesisi'nde düzenlendi.

1. Fareleri, çevresel zenginleştirme ile standart 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde tutun.
2. Tüm deneyler için erkek ve dişi C57BL / 6 fareleri (3-5 haftalık) kullanın.

2. Çözeltilerin Hazırlanması

1. 29 mM NaHCO₃, 11 mM glikoz, 120 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO₄, 2.2 mM MgCl₂, 2.77 mM CaCl_2'den oluşan 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın.
2. 29 mM NaHCO3, 11 mM glikoz, 241.5 mM sükroz, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO₄, 2.2 mM MgCl₂, 2.77 mM CaCl₂ içeren 200 mL sükroz-ACSF (sACSF) hazırlayın. ACSF ve sACSF'ye CaCl₂ eklemeden önce, 7.4'lük bir pH oluşturmak ve kalsiyum çökelmesini (bulanıklık) önlemek için çözeltileri karbojen (% 95 O₂ ve% 5 CO₂) ile gazlayın.
3. 70 mM potasyum glukonat, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg_2-ATP, 0.3 mM Na_3-GTP'den oluşan K+ bazlı hücre içi çözelti hazırlayın, nihai pH 7.3 (KOH kullanılarak ayarlanır).
   not: Hücre içi solüsyonların 0.22 μm filtrelerle süzülmesi ve -20 °C'de 0.5 mL alikotlarda saklanması önerilir.

3. Beyin Sapının Hazırlanması

1. Beyin sapı ekstraksiyonundan önce, sACSF'yi karbojen ile dengeleyin ve bir buz bulamacı oluşturmak için -80 ° C'de 25 dakika soğutun.
2. Fareyi oksijene doymuş izofluran (% 3-5) (3 mL / dak) ile uyuşturun. Arka pençe refleksleri olmadığında, keskin paslanmaz çelik makasla farenin kafasını kesin.
3. Bir tıraş bıçağı (# 22 yuvarlak) kullanarak deride sagital bir kesi yaparak kafatasını ortaya çıkarın.
4. Bir çift standart desen makasının sivri ucunu kullanarak lambdada küçük bir kesi yapın ve uzunlamasına çatlak boyunca kesin.
5. Bir çift sığ kıvrımlı Pearson rongeur kullanarak eşleştirilmiş parietal ve oksipital kemikleri dikkatlice yansıtın.
   not: Bu prosedür sırasında beyin, önceden hazırlanmış buz gibi sACSF bulamacı kullanılarak sürekli olarak yerinde yıkanır.
6. Parieto-oksipital sulkusu ve kaudal medullayı kesmek için bir tıraş bıçağı (# 11 düz) kullanarak beyin sapını ön beyinden ve kemikli kılıfından izole edin.
7. İzole edilmiş beyin sapı ventral ucunu önceden kesilmiş bir trapez polistiren blok üzerine monte edin. Diseke edilen dokunun etrafındaki fazla sıvıyı çıkarmak ve kesme aşamasına iyi bir doku yapışması sağlamak için bir kağıt mendil fitili kullanın.
   not: Polistiren blok, orta beynin rostral ucunun omuriliğe oturmasını ve incelmesini sağlamak için yamuk şeklinde kesilir.
8. Polistiren bloğu, takılı beyin sapı rostral ucu ile kesme aşamasına sabitlemek için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın.
9. 0,16 mm/sn'lik bir ilerleme hızı ve 3,00 mm'lik titreşim genliği kullanarak, MVN'nin 200 μm'lik enine dilimlerini hazırlayın.
   not: MVN'nin konumu, Paxinos ve Franklin fare beyin atlası kullanılarak belirlenir. MVN (atlasta MVe olarak listelenmiştir) 4. ventrikülün hemen ventrolateralinde yer alır ve serebellumun bağlanmasından hemen önce (inferior colliculi ile obeks arasında) en büyüğüdür.
10. Kayıttan önce en az 30 dakika boyunca 25 °C'de karbojene ACSF'de oturan bir filtre kağıdı diskine dilimleri aktarmak için plastik kesilmiş bir pipet kullanın.

4. Enstrümanlar

1. Tüm hücre yama kelepçesi tekniğini gerçekleştirmek için standart bir elektrofizyolojik kurulum kullanın.
2. Mikropipetleri bir mikropipet çekicide iki aşamalı bir protokol (ısı adımı 1: 70; ısı adımı 2: 45) kullanarak hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
3. Banyoya yerleştirildiğinde, mikropipetler dahili bir çözelti ile 3 ila 5 MΩ arasında değişen bir nihai dirence sahip olmalıdır.
   not: Kullanılan ayarlar oda içindeki sıcaklığa bağlı olarak değişebilir ve oldukça sık değişebilir.

>5. Tam Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi

1. MVN'deki tek tek nöronlardan tam hücre yama kelepçesi kayıtları elde etmek için, kayıt pipeti içinde K + bazlı bir dahili çözüm kullanılır.
2. Tek bir doku dilimini inkübasyon odasından kayıt odasına aktarın ve U şeklinde bir ağırlık üzerinde naylon iplik kullanarak sabitleyin. Kayıt odasını karbojene ACSF ile 25 °C'de 3 mL/dk akış hızında sürekli olarak perfüze edin.
3. Bir mikropipeti dahili solüsyonla doldurduktan sonra, düşük güçlü (10x) bir objektif lens kullanarak MVN'yi bulun. Yüksek güçlü (40x) bir objektif kullanılarak, MVN içindeki bireysel nöronlar bulunabilir.
   not: Hücre kalitesi, tüm hücre konfigürasyonunu elde etmeye çalışırken hücrenin kaliteli kayıtlarını ve dayanıklılığını sağlamak için çok önemlidir. Uygun bir hücre, küresel bir şekil, yansıtıcı bir hücre zarı ve görünmez bir çekirdek gösterecektir. Uygun olmayan bir hücre, büyük bir görünür çekirdeğe (yumurta benzeri) ve şişmiş/küçülmüş bir görünüme sahip olacaktır.
4. Dokuyu pipetle kırmadan önce, kalıntıları pipet ucundan uzaklaştırmak için az miktarda pozitif basınç uygulayın.
5. Mikromanipülatörü kullanarak pipeti seçilen nörona doğru hareket ettirin ve nöronal zar üzerinde küçük bir çukur oluşmalıdır.
   Pozitif basıncı serbest bırakın ve az miktarda negatif basınç uygulayın.
6. 1 GΩ'luk bir sızdırmazlık elde edildiğinde, zarı yırtmak ve tam hücre konfigürasyonu oluşturmak için emme portu aracılığıyla pipet tutucusuna nazik, kısa ve keskin negatif basınç uygulayın.
7. Standart teknikleri kullanarak tüm hücre akım kelepçesi kayıtları yapın.

6. Bireysel Medial Vestibüler Çekirdek Nöronlarına Sinüzoidal ve Stokastik Gürültü Uygulama

1. Nöronal eşiği ve ateşleme hızını belirlemek için stokastik ve sinüzoidal gürültüyü 3 ila 24 pA arasında bir genlik aralığında uygulayın.
2. Daha düşük ve daha yüksek uyaran yoğunluklarını gruplandırarak duyusal eşiği belirleyin ve herhangi bir farkı gözlemlemek için bir ANOVA gerçekleştirin (Şekil 1'de gösterildiği gibi).
3. Her bir akım seviyesi için depolarize edici akım adımının enjekte edildiği/edileceği 10 saniyelik süre boyunca ortalama ateşleme hızını hesaplayın (yani, toplam 7 bölüm; Şekil 2).
4. Mevcut çizime karşı bir ateşleme hızı oluşturmak için ortalama ateşleme hızı değerlerini kullanın ve en uygun hattın gradyanını belirlemek için doğrusal bir regresyon analizi gerçekleştirin. En uygun çizginin gradyanı, nöronal kazancı gösterir.

Sonuçlar

Şekil 1: 12 pA eşiğinin objektif olarak belirlenmesi. 12 pA'dan az (3 ve 6 pA) ve 12 pA'dan (18 ve 24 pA) fazla ateşleme oranları toplandı ve ortalaması alındı. Bu ortalamalar daha sonra bir ANOVA ve sahte ile >12 pA arasında ve <12 pA ile >12 pA arasında istatistiksel anlamlılık kullanılarak analiz edildi. *p < 0.05.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CaCl2	Scharlau Belediyesi	CA01951000	ACSF ve sACSF için kullanılır
D-(+)-Glikoz	Sigma	G8270	ACSF ve sACSF için kullanılır
EGTA (EGTA)	Sigma	E0396-25G	K bazlı hücre içi çözelti için kullanılır
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H3375-25G	K bazlı hücre içi çözelti için kullanılır
Kartal	Kimyasal tedarik	PA054-500G	ACSF, sACSF ve hücre içi çözelti için kullanılır
K-glukonat	Sigma	P1847-100G	K bazlı hücre içi çözelti için kullanılır
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	K bazlı hücre içi çözelti için kullanılır
MgCl	Kimyasal tedarik	MA00360500	ACSF ve sACSF için kullanılır
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	K bazlı hücre içi çözelti için kullanılır
NaCl (Doğal)	Kimyasal tedarik	SO02270500	ACSF ve hücre içi çözelti için kullanın
NaH2PO4.2H 2O	Ajax	AJA471-500G	ACSF ve sACSF için kullanılır
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	ACSF ve sACSF için kullanılır
Sakaroz	Kimyasal tedarik	SA030-500G	sACSF için kullanılır
İzofluran	Henry Schein	1169567762	Fareleri uyuşturmak için kullanılır
ekipman
Borosilikat cam kılcal damarlar	Warner enstrümanları	GC150T-7.5	1,5 mm Dış Çap, 1,16 mm İç Çap, 7,5 cm < / > uzunluk
Veri toplama yazılımı	Saksograf		Elektrofizyoloji ve analiz için kullanılır
Friedmen-Pearson Rongeurs	Dünya hassas enstrümanlar	14089 Haber Bülteni	Diseksiyon için kullanılır
Mikropipet çektirme	Narishige (Narishig)	PP-830	Mikropipet için kullanılır
Çoklu kelepçe amplifikatör	Akson aletleri	700 milyar	Elektrofizyoloji için kullanılır
pH metre	Bilimsel sper	860033	Dahili çözüm için kullanılır
Standart desen makası	FST (Türkçe)	14028-10	Diseksiyon için kullanılır
Sutter mikromanipülatörü	Sutter	MP-225/M	Elektrofizyoloji için kullanılır
Dik mikroskop	Olympus	BX51WI	Elektrofizyoloji için kullanılır
Vibratom	Leica Belediyesi	VT1200	Beyin dokusunu dilimlemek için kullanılır

Serisi Serisi Serisi Serisi · Serisi Serisi Serisi