Canlı Hücre Floresan Görüntüleme ile Kültürlenmiş Nöronlarda Hidrojen Peroksit Seviyelerinin Saptanması

Özet

Kaynak: Terzi, A. ve ark., ROS Nöronal Gelişim Sırasında Canlı Hücre Görüntüleme.J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, roGFP2-Orp1 biyosensörü ve canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak retinal ganglion hücrelerinde gerçek zamanlı hidrojen peroksit seviyelerini tespit etmek için bir teknik göstermektedir. Hücre hazırlama, floresan görüntüleme ve hidrojen peroksit seviyelerinin miktarının belirlenmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

>1. Kültürlenmiş retinal ganglion hücresi (RGC) nöronlarının in vitro reaktif oksijen türleri (ROS) görüntülemesi

1. Görüntüleme gününde (tipik olarak hücre kaplamasından 6-24 saat sonra), RGC aksonlarının büyümesini doğrulamak için retinal ganglion hücrelerini mikroskop altında kontrol edin.
2. Canlı hücre görüntüleme için, lamelleri kültür kabından canlı hücre görüntüleme odasına aktarın.
3. Görüntüleme için mikroskop ayarlayın. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) objektifi, OG590 uzun geçişli kırmızı filtre ve bir EM-CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
4. Görüntülemeden önce, zebra balığı hücre kültürü ortamını serum ve antibiyotiklerle (ZFCM)(+)) serum ve antibiyotik içermeyen zebra balığı hücre kültürü ortamıyla (ZFCM(-)) değiştirin.
5. Hücreler 10x objektifle konumlandırıldıktan sonra, yüksek NA yağa daldırma objektifi kullanarak 60x büyütmede görüntüler elde edin. Ek bir 1,5x büyütme kullanın.
6. İlk olarak, DIC görüntülerini edinin. Ardından, uygun bir filtre seti kullanarak roGFP2-Orp1'i görüntüleyin. 405/20 ve 480/30 nm uyarma filtrelerine sahip roGFP2-Orp1'i sırayla uyarın ve emisyon ışığı dikroik ayna 505DCXR'yi geçtikten sonra 535/30 nm emisyon filtresi ile görüntü elde edin.
7. İlk görüntü setini çektikten sonra, medyayı farklı tedavi solüsyonları içeren medyayla değiştirin. pH ve ozmolarite değişikliklerini önlemek için ortam her 30 dakikada bir görüntülenmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 mm kültür kabı	Sarstedt	83-3900
Kapak camı	Corning	2850-22
Tek Kullanımlık Petri Kapları (100 x 15 mm)	VWR (VWR)	25384-094
Fetal Sığır Serumu	ThermoFisher Bilimsel	26140087
Ters Mikroskop	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Bilimsel	23017-015
Leibovitz'in fenol kırmızısı ile L-15 Medium	Gibco/Fisher Bilimsel	11-415-064
Leibovitz'in fenol kırmızısı içermeyen L-15 Medium'u	Gibco/Fisher Bilimsel	21-083-027
Penisilin / streptomisin	ThermoFisher Bilimsel	15140122
Fenol Kırmızısı	Sigma Aldich ·	P0290 Serisi
Poli-D-Lizin (PDL)	Sigma Aldich ·	P7280 Serisi
Steritop 0,22 μm filtre	Kırlangıç	S2GPT05RE
Kalsiyum Klorür Dihidrat	Balıkçı Bilimsel	C79-500
glikoz	Sigma Aldrich	G7528
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma Aldrich	H4034

Belediyesi arası Serisi Serisi · Serisi · Serisi