Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik incelemesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Ön Hazırlık (İsteğe Bağlı: 1 Gün Önceden Hazırlanın)
- Üç tip yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi hazırlayın (Normal, Sükroz ve Kurtarma Çözeltileri, her biri 1 L; bakınız Tablo 1). Çözeltilerin ozmolalitesini 300 ± 10 mOsm'ye ayarlayın ve ACSF-Sükrozu donma noktasına (0-4 °C) kadar soğutun.
not: Düşük sodyumlu bir kesme çözeltisinin (ACSF-Sükroz) kullanılması, akut dilimlerin yüzeysel katmanlarındaki nöronların canlılığının korunmasına yardımcı olur.
- Kırmızı bir florofor (örneğin, Alexa-594) ve yeşil bir sentetik kalsiyum göstergesi (örneğin, Oregon Green BAPTA-1; bakınız Tablo 1) içeren 0.75 mL yama çözeltisi hazırlayın. Kaydedilen hücrelerin post hoc morfolojik tanımlaması gerekiyorsa, yama çözeltisine biyositin (bakınız Tablo 1) ekleyin.
- Çözeltinin ozmolalitesini 5 mOsm ± 280 ve pH'ı 7.35 ± 0.5'e ayarlayın. Solüsyonu her zaman buzdolabında veya buz üzerinde saklayın.
not: Kalsiyum indikatörünün seçimi, dinamik aralığına ve araştırılan Ca2+ olaylarının doğasına dayanmalıdır.
- Bir mikropipet çektirmesi kullanarak, ≈ 2 μm uçlu (3-5 MΩ pipet direnci) borosilikat cam kılcal damarlardan (Malzeme Tablosuna bakınız) yama pipetleri ve 2-5 μm uçlu borosilikat teta-cam kılcal damarlardan stimülasyon pipetleri hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu)
not: Belirli bir çap ve şekle sahip pipetler yapmak için çektirme ayarları, çektirme filament tipi ve belirli bir cam türü için rampa testi sonuçları ile belirlenecektir.
2. Tam Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları
- Lazer taramalı iki fotonlu bir mikroskobun objektifinin (büyütme: 40x, sayısal açıklık: 0.8) altına yerleştirilmiş bir banyoda bir hipokampal dilim yerleştirin. Banyoyu 30-32 ° C'de 2.5-3 mL / dak hızında ısıtılmış oksijenli ACSF-Normal ile sürekli olarak perfüze edin.
- Boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgilenilen bir hücreyi bulmak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) veya Dodt-SGC mikroskobu kullanın.
not: Hedeflenen nöron popülasyonuna bağlı olarak, ilgilenilen hücreleri kolayca bulmak için transgenik bir fare modeli kullanılabilir. Bu durumda, bu adım bir floresan ışık kaynağı kullanılarak değiştirilebilir.
- Bir stimülasyon pipetini kırmızı florofor içeren bir ACSF-Normal solüsyonu ile doldurun (örn., Alexa-594).
- Stimülasyon pipetini (bir elektrik stimülasyon ünitesine bağlı), uç ilgilenilen hücre ile aynı bölgede olacak şekilde dilimin üzerine yerleştirin.
- Yama pipetini yama çözeltisiyle doldurduktan ve bir kafa aşamasına taktıktan sonra, ucu doğrudan ilgilenilen hücrenin üzerinde olacak şekilde dilimin üzerine yerleştirin.
- Bir şırıngayı üç bir musluka yerleştirin ve plastik tüp aracılığıyla yama pipetine bağlayın. Şırıngayı kullanarak yama pipetine (≈ 0,1 mL) sabit pozitif basınç enjekte edin. Musluku "yakın" konumda tutun.
- Amplifikatör kontrol yazılımı modülünü etkinleştirin ve "VC" düğmesine tıklayarak voltaj-clamp moduna geçin. Elektrofizyolojik sinyallerin alınması için elektrofizyolojik veri toplama yazılımını (örn. clampex) açın ve pipet direncindeki değişiklikleri izlemek için gerekli olan bir kare voltaj darbesi (5 mV, 10 ms) sürekli olarak göndermesini sağlamak için "Membran Testi" simgesine tıklayın.
- Yama pipetini, hedeflenen hücrenin tam üstüne gelene kadar indirin. Hücre zarı ile temas ettikten sonra, vanayı "açık" konuma getirerek basıncı kaldırın.
not: Pipet direncinde küçük bir artış (≈ 0.2 MΩ) görüldüğünde hücre zarı ile temas tespit edilir ve hücre üzerinde küçük bir girinti pozitif basınçtan kaynaklanır.
- Yazılım tarafından sağlanan pipet direnci 1 GΩ'a ulaşana kadar vanaya takılı boş bir şırınga kullanarak yama pipetine hafif bir negatif basınç uygulayın. Veri toplama yazılımının 'Membran Testi' penceresinde, hücreyi -60 mV'de sıkıştırın.
- Hücre açılana ve tüm hücre konfigürasyonu elde edilene kadar negatif basınç uygulamaya devam edin. Bu hücre durumunun tespiti, pipet direncindeki ani değişime (internöron tipine bağlı olarak 1 GΩ'dan 70-500 MΩ'a) ve 'Membran Testi' penceresinde büyük kapasitif geçici akımların ortaya çıkmasına dayanır.
3. İki fotonlu kalsiyum (Ca2+)Görüntüleme
- Uyarıcı postsinaptik yanıtlarla ilgileniyorsanız, ACSF banyosuna GABAA reseptör bloker gabazin (10 μM) ve GABAB reseptör bloker CGP55845 (2 μM) ekleyin.
- Amplifikatör kontrol yazılımı modülünde, "CC" düğmesine tıklayarak yama konfigürasyonunu akım kelepçesine ayarlayın ve depolarize edici akımın (0.8-1.0 nA, 1 s) somatik enjeksiyonlarına yanıt olarak hücrenin ateşleme modelini kaydedin. Hücrenin yama çözümünde bulunan göstergelerle dolması için en az 30 dakika bekleyin.
not: Hücrenin ateşleme modeli ve aktif özellikleri, örneğin hızlı sivrilen hücreler gibi alt tipini tanımlamak için kullanılabilir. Kalsiyum geçişlerini (CaT'ler) kaydetmeye başlamadan önce gösterge konsantrasyonunun difüzyon yoluyla stabilize olması önemlidir (sorun giderme için Tablo 2'ye bakın).
- AP ile uyarılmış CaT'ler
- Görüntü alma yazılımını kullanarak görüntüleri almaya başlayın. Kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendriti bulun. Görünür bir yanıt sağlamak için, önce bir proksimal dendrit (≤ 50 μm) seçin, çünkü AP geri yayılımının etkinliği GABAerjik internöronlarda mesafe ile önemli ölçüde azalabilir.
- Görüntü alma yazılımındaki 'dikdörtgen aracı' kullanarak, hedeflenen bölgeyi yakınlaştırın ve "xt" (linescan) moduna geçin. Taramayı ilgilenilen dendritik dal boyunca konumlandırın. Toplama yazılımındaki lazer yoğunluk kontrolörleri ile, fototoksisiteyi önlemek için iki fotonlu lazeri, temel yeşil floresansın çok az görülebildiği minimum güç seviyesine ayarlayın.
- Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı 'Protokol' penceresinde ve görüntü elde etme yazılımında, istenen genlikte somatik akım enjeksiyonu içeren istenen sürede bir kayıt denemesi oluşturun.
- Görüntü alma yazılımını kullanarak, "Kaydı başlat" düğmesine tıklayın ve floresansı 1-2 saniye boyunca sürekli olarak elde edin. Görüntü alımını 3-10 kez tekrarlayın. Foto hasarı önlemek için tek taramalar arasında en az 30 saniye bekleyin. Bir dendrit boyunca birden fazla noktada çizgi taramaları alıyorsanız, sipariş etkilerinden kaçınmak için bunları rastgele sırayla alın.
- Sinaptik olarak uyarılmış CaT'ler
- Kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendriti bulun.
- Stimülasyon pipetini, ilgilenilen dendritin üzerindeki dilimin yüzeyine yerleştirin. Tüm hücre konfigürasyonunu bozmamak için hareketi en aza indirerek stimülasyon pipetini yavaşça yerine indirin. Pipeti dendritten 10-15 μm uzağa yerleştirin.
- Aspiny dendritlerdeki sinaptik mikro alanların konumunu görselleştirmek için, görüntü elde etme yazılımında 'xt' (linescan) moduna geçin ve çizgiyi ilgilenilen dendritik dal boyunca konumlandırın.
- 'Protokol' Penceresinde (elektrofizyoloji veri toplama yazılımının) ve görüntü elde etme yazılımında, deneme başladıktan sonra stimülasyon ünitesini tetikleyen bir kayıt denemesi oluşturun.
- Edinme yazılımını kullanarak, dendrit boyunca 1-2 saniye boyunca sürekli olarak taramak için "Kaydı başlat" düğmesine tıklayın. Foto hasarı önlemek için taramalar arasında 30 saniye bekleyerek alımı 3-5 kez tekrarlayın.
not: Taramanın uzunluğu, uyarılan olayın kinetiğine bağlı olarak ayarlanabilir, ancak fotohasarı önlemek için en aza indirilmelidir (sorun giderme için Tablo 2'ye bakın).
- Ele alınan spesifik soruya bağlı olarak farklı koşullarda (örneğin, farklı yoğunluk/stimülasyon uzunluğu, farmakolojik bir blokerin tanıtılması vb.) adım 3.4.5'i tekrarlayın.
- Hücre sağlığın bozulma belirtileri gösterdiğinde edinimi durdurun: -45 mV'nin altında depolarizasyon, başlangıç Ca2+ seviyesinde artış, dendritlerin morfolojik bozulması (örneğin, kanama, parçalanma; sorun giderme için Tablo 2'ye bakınız).
- Hücrenin morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipetinin konumunun kaydını tutmak için, kırmızı kanaldaki hücrenin bir Z yığınını edinin. Edinme yazılımını 'xyz' modunda kullanarak, tüm hücrelerin tümünü tüm işlemler dahil olacak şekilde görüntülemek için üst ve alt yığın sınırlarını ayarlayın. 'Adım boyutunu' 1 μm olarak ayarlayın ve "Kaydı başlat" düğmesini kullanarak yığın alımını başlatın.
- Z yığını alımı tamamlandığında, yığının tüm odak planlarını üst üste bindirmek ve alımın kalitesini doğrulamak için yazılımdaki "Maksimum projeksiyon" seçeneğini kullanın. Ardından, yama pipetini dilimden yavaşça geri çekin.
- Dilimi post hoc morfolojik tanımlama için sabitlemek için, dilimi düz bir boya fırçası kullanarak banyodan hızlı bir şekilde çıkarın ve ACSF dolu bir Petri kabındaki iki filtre kağıdı arasına yerleştirin. ACSF'yi %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisiyle değiştirin ve tabağı gece boyunca 4 °C'lik bir odada veya buzdolabında bırakın.
Tablo 1: Çözüm tarifleri. Protokol sırasında kullanılan çözeltiler için bileşikler ve konsantrasyonlar.
Serisi
| çözüm | parça | Konsantrasyon (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl (Doğal) | 124 |
| Kartal | 2,5 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 2 |
| NaHCO3 | 26 |
| glikoz | 10 |
| CaCl2 | 2 |
| ACSF-Kurtarma | NaCl (Doğal) | 124 |
| Kartal | 2,5 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| glikoz | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Sükroz | Kartal | 2 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| glikoz | 10 |
| Sakaroz | 219 |
| CaCl2 | 1 |
| K+ tabanlı Yama çözümü | K+-glukonat | 130 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 10 |
| MgCl2 | 2 |
| Fosfokreatin di(tris)tuzu | 10 |
| ATP-Tris | 2 |
| GTP-Tris | 0,2 |
| Biyosit | 72 |
| Alexa-594 | 0,02 |
| Oregon Yeşili-BAPTA-1 | 0,2 |
Tablo 2: Sorun giderme tablosu. Ca2+ görüntüleme deneyi sırasında ortaya çıkabilecek yaygın sorunlara çözümler.
| sorun | çözüm |
| Sağlıklı nörona yama yapılamıyor | Dilimlerin sağlıksız olduğuna dair işaretler olup olmadığını kontrol edin: küçülmüş veya şişmiş hücreler, görünür çekirdekler vb. Eğer öyleyse, dilimleri atın. Ayrıca yama pipet direncini ve yama çözeltisinin ozmolalitesini doğrulayın; Değerler uygun aralıkta değilse bunları değiştirin. |
| Dendritlerden gelen floresan sinyali düşük | Hücrenin dolması için daha uzun süre bekleyin. Bir tıkanıklık yama çözeltisinin hücreye yayılmasını engelliyorsa, yama pipetine az miktarda negatif basınç uygulamayı deneyin. |
| Elektriksel stimülasyon bir Ca2 + tepkisi uyandırmaz | Elektrofizyolojik kayıtta bir artefakt olup olmadığını kontrol edin. yoksa, kısa devre/uyarıcı ünite arızası olup olmadığını kontrol edin. Varsa, stimülasyon yoğunluğunu artırın veya stimülasyon pipetini dendrite yaklaştırın. Sinaptik tepkileri incelerken dendritlerin doğrudan depolarizasyonunu önlemek için stimülasyon elektrodu ile dendrit arasındaki mesafenin 8 um'yi geçmemesi gerektiğine dikkat edilmelidir. |
| Uyarılmış Ca2+ sinyali çok yüksek/Ca2+ göstergesini doyuruyor | Lazer gücünü azaltın. Sorun birden fazla hücrede devam ederse, daha düşük Ca2+ afinitesine sahip farklı bir Ca2+ göstergesi kullanın. |
| Temel Ca2+ sinyali, deney sırasında kademeli olarak artmaktadır | Bireysel taramalar arasında daha uzun bir süre bekleyin. Referans değer hala artıyorsa, alımı durdurun; Hücrenin sağlığının muhtemelen azaldığını gösterir. |
| Taramalar sırasında Ca2+ sinyalinin genliği azalır | Lazer gücünü azaltın veya uzaklaştırın (varsa). |
| Dendrit taramadan sonra parçalanıyor ("kanama") | Lazer gücünü azaltın veya uzaklaştırın. Kanama hedeflenen dendrit ile sınırlıysa, başka bir dendrit seçin ve lazer gücünü azaltın / uzaklaştırın. Birden fazla dendrit kanıyorsa, alımı durdurun. |
| Floresan sinyalleri, taramalardan sonra tarama hattından "sürükleniyor" | ACSF perfüzyonunun hızını azaltarak dilimdeki hareketi azaltın. Yama yapmadan önce, dilimin bir ağ ile yerine güçlü bir şekilde sabitlendiğinden emin olun. |