Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kayıt Enjeksiyonlu Pipetin Montajı
- Bir pipet çektirme kullanarak yaklaşık 7 cm uzunluğunda bir cam kılcal damarı (1 mm dış çap) çekin.
- Kılcal ucu kırın ve diyaframı ışık mikroskobu altında kontrol edin. İç çapın 30 μm ila 40 μm arasında olduğunu onaylayın.
- Cam pipetin konik olmayan ucundan yaklaşık 1 cm çıkıntı yapacak şekilde cam kılcal damara 7 cm uzunluğunda gümüş bir tel yerleştirin.
- Fazla filamenti cam kılcal damara dik olarak bükün.
- 30 G'lik bir hipodermik iğnenin şaftına bir damla esnek plastik yapıştırıcı sürün.
- Şekil 30'de sunulan şemalara göre cam pipete 1 G'lik bir hipodermik iğne yerleştirin.
- Cam pipet ile hipodermik iğne arasındaki bağlantıdan uygun bir sızdırmazlık sağlamak için ikinci bir yapıştırıcı kaplama ekleyin.
- Tutkalın düzgün bir şekilde kürlenmesini sağlamak için pipeti ucu yukarı bakacak şekilde yaklaşık 12 saat kurumaya bırakın. Bitmiş sonuç Şekil 2'de gösterilmiştir.
>NOT: Bu prosedür akut deneylerde yapılır ve pipet ucunun sterilizasyonu gerekli değildir.
2. Hayvan Hazırlama
- Fareyi bir anestezi kutusuna yerleştirin.
- 5 ila 10 dakika boyunca% 4 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin.
- Vücut ısısını 37 ° C'de tutmak için hayvanı bir ısıtma yastığı ve rektal prob ile stereotaksik bir masaya yerleştirin. Anesteziyi sürdürmek için% 2 izofluran içeren bir burun konisi kullanın. Kulak çubukları ve bir diş tutucu kullanarak farenin kafasını sabitleyin.
- Göz bebeği genişlemesine yardımcı olmak için %1 Atropin damlası da dahil olmak üzere oftalmik merhem veya göz damlası uygulayın. Kuruluğu önlemek için yaklaşık her 30 dakikada bir yağlama damlaları uygulayın.
- Kafayı tıraş edin ve% 10 povidon-iyot ile temizleyin.
- Lokal anestezi için saçlı deri altına 0,5 ml %2'lik lidokain enjekte edilerek cildi kaldırarak ve iğnenin ucunu sokarak 2-3 yer halinde enjekte edin.
- Bir ayak parmağını kıstırarak ve hareket eksikliğini gözlemleyerek yeterli bir anestezi seviyesini onaylayın. Ek olarak, kalp atış hızının normal değerler (300 ila 400 atım/dak) içinde olduğundan emin olmak için izlenmesi gerekir.
- Hem koronal hem de sagital dikişleri ortaya çıkarmak için kafa derisini # 10 neşter bıçağı ile medyan boyunca düz bir çizgide kesin.
- Kafatasını kaplayan dokuyu cerrahi bir spatula ile kenara iterek Lambda ve Bregma noktalarını ortaya çıkarın.
- Kafatasını, Bregma ve Lambda pozisyonları aynı düzlemde olacak şekilde düzleştirin.
- Referans noktasını ayarlamak için, Bregma'nın hemen üzerine yerleştirmek için monte edilmiş bir cam tüpe sahip stereotaksik bir cihaz kullanın. Bu, anteroposterior ve medial-lateral ölçüm koordinatları için "sıfır" olacaktır.
- Stereotaksik montajı gerekli koordinatlara hareket ettirerek ilgi noktasını ayarlayın, stereotaksik koordinatları not edin ve hedef alanın etrafına kraniyotominin nerede yapılacağını gösteren bir kare çizin.
- Kemik malzemesini çıkarmak için işaretli kare boyunca yavaşça sterilize edilmiş bir matkapla cerrahi matkap kullanın. Aynı bölgede çok uzun süre delmemeye dikkat edin, çünkü ısı üretecek ve kortekste lezyonlara neden olacaktır.
- Kraniyotomiyi sınırlayan kemik yeterince inceldiğinde, korteksi açığa çıkarmak için kraniyal bölümü cımbızla dikkatlice çıkarın.
- Doku kurumasını önlemek için açıkta kalan korteksi sık sık yapay beyin omurilik sıvısı ile yıkayın.
not: Enjeksiyonun ucu nüfuz edebilecek kadar sağlam olduğu için sıçan üzerinde dura mater çıkarılması gereksizdir.
3. Enjeksiyon Sisteminin Doldurulması ve Montajı
- 5-10 μl mikroşırıngayı mineral yağ ile aspirasyon ile doldurun.
- Hipodermik iğneyi sabit cam pipet ile %0,5 Chicago Sky Blue (CSB) ve 300 μM γ-aminobütirik asit (GABA) çözeltisi veya %0,5 CSB 9 içeren %2 lidokain çözeltisi ile doldurun. Tüm çözeltileri tuzlu su ile seyreltin.
- Bol miktarda madde olması durumunda, normal bir şırınga kullanarak doldurun ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için olağan önleyici teknikleri kullanın.
- Daha pahalı maddeler söz konusu olduğunda, enjeksiyonu doldurmak için mineral yağ kullanılabilir ve kimyasal ajan daha sonra aspirasyon yoluyla eklenebilir. Mineral yağ ve su arasındaki yoğunluk farkı nispeten yüksektir, bu nedenle bu madde sulu çözeltilerin enjekte edilmesi için iyi bir adaydır.
not: Her iki sıvı arasındaki ayrımı doğrulamak için bir boya eklenebilir.
- Enjeksiyon pipetini doldurmak için, 1 ml'lik bir şırıngayı solüsyonla aspire edin ve yavaşça pipete enjekte edin.
- Şekil 1'de gösterilen bölgelerdeki sızıntılara dikkat edin, bu alanları temiz bir şekilde temizleyin ve solüsyonu şırınga ile yavaşça enjekte ederek sızıntıları gözlemleyin.
- 1 ml şırıngayı çıkarın. Bunu yaparken, vakumun çözeltiyi enjeksiyon pipetinden çıkarmaması için piston üzerinde hafif bir baskı uygulayın.
- Mikroşırıngayı mineral yağ ile aspire edin ve doldurulmuş enjeksiyon pipetine sıkıca takın. Ardından, monte edilmiş enjeksiyondan fazla çözeltiyi gazlı bezle dikkatlice silin.
- Ucun tıkalı olmadığını doğrulamak için cam pipetin ucunda küçük bir damla oluşmasını görecek kadar çok küçük bir hacim enjekte edin.
- Enjeksiyonu mikro pompa sistemine monte edin ve iyi sabitlendiğinden emin olun.
- Enjeksiyon ucunu dikkatlice hedef koordinatlara yerleştirin ve ucu korteksin yüzeyine indirin.
- Uygun anatomik koordinatları kullanarak stereotaksik cihazı kullanarak enjeksiyonu hedef yapıya (superior colliculus) yavaşça indirin.
- Doku kurumasını önlemek için açıkta kalan korteksi ılık agar ile örtün.
4. Enjeksiyon ve Tersinir İnaktivasyon
- Mikroenjeksiyon pompasını 40 nl/dk'da 400 ila 800 nl enjekte edecek şekilde ayarlayın ve enjeksiyonu başlatmak için Çalıştır'a basın. Ani artış oranının enjeksiyon sırasında bir azalma göstereceğini unutmayın.
NOT: Deney düzeneğinde, sinirsel aktivite, GABA dağıtımının bitiminden sonraki bir saat içinde geri kazanıldı. Mikroenjeksiyon şırıngasına basınç uygulamak ve enjeksiyonu gerçekleştirmek için kalibre edilmiş herhangi bir mekanik cihaz kullanılabilir.
- Elektrofizyolojik verileri elde ettikten sonra, yerel Hayvan Etiği Topluluğu tarafından onaylanan bir yöntem kullanarak ötenazi yapın.
