Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Çözeltilerin Hazırlanması
- Tablo 1'de listelendiği gibi yayınlanmış çalışmamızda açıklanan bileşenleri içeren 500 mL standart yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın.
- Taze bir ACSF çözeltisi hazırlamak için deiyonize su ile temiz cam kaplar kullanın. Sodyum klorür (NaCl), potasyum klorür (KCl), Di-hidrojen sodyum fosfat (NaH2PO4), sodyum bi-karbonat (NaHCO3), magnezyum sülfat (MgS04), D-glikoz eklemek için kullanmadan önce spatulaları deiyonize su ile temizleyin ve kurulayın ve çözeltiyi %95 O2 /% 5 CO2 ile köpürttükten sonra kalsiyum klorürü (CaCl2) ekleyin~ 20 dakika (Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi) 500 mL deiyonize su ile karıştırın. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
- ACSF'nin herhangi bir yağış olmadan tamamen temiz olduğundan emin olun. Ardından pH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın. %95O2 ve %5 CO2'den oluşan bir gaz karışımı ile ~20 dakika köpürtün.
- Tablo 2'de açıklanan kimyasalları içeren 250 mL dilim kesme solüsyonu hazırlayın.
- KCl, magnezyum klorür (MgCl2), NaH2PO4, NaHCO3, kolin·Cl ve D-glikoz ekleyin ve en son 1.1.1'de belirtildiği gibi kalsiyum klorürü (CaCl2) 250 mL deiyonize suya ekleyin ve 1.1.1 ve 1.1.2'de açıklandığı gibi çözün.
- % 95 O2/5% CO2 ile köpürtüldükten sonra, çözeltiyi 15-20 dakika dondurucuya koyun, böylece kesme çözeltisi buz gibi soğuk olur ve kısmen donar.
not: Bu kesme solüsyonunu 1-2 aylık farelerden dilimler yaparken kullanıyoruz; Formül 2 aydan büyük fareler için farklılık gösterebilir.
- Steril endotoksin içermeyen izotonik salin (% 0.9 NaCl) içinde çözerek bir lipopolisakkarit (LPS) çözeltisi hazırlayın. LPS intraperitoneal olarak uygulanır (0.5 mg / kg) ve 2 saat sonra kayda başlar.
2. Prefrontal Korteks Diliminin Hazırlanması
- Kesme solüsyonunu dondurucudan çıkarın ve bir rüşvet elde etmek için homojenize edin. Çözeltiyi buzun üzerine yerleştirin ve% 95 O%2/5% CO2 ile sürekli olarak köpürtün.
- Büyük, keskin bir makas kullanarak, tarif edildiği gibi bir farenin kafasını hızlı bir şekilde kesin ve kafayı hemen buz gibi (0-4 ° C) kesme solüsyonu ile doldurulmuş bir behere koyun.
- Kafatasının üst kısmını ince bir makasla orta hat boyunca kaudal-nazal yönde kesin ve yan kafatası kısımlarını çıkarın. Beyni ince bir spatula ile çıkarın ve buz gibi kesme solüsyonuna bırakın.
not: Adım 2.2-2.3 hızlı bir şekilde yapılmalıdır (ideal olarak 1 dakika <).
- Beyni, buzla dolu 9 cm'lik bir Petri kabının kapağına yerleştirin. Beyni buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile durulayın. Beyincik ve koku soğancığını bir tıraş bıçağıyla kesin.
- Bir vibratomun numune tutucusuna siyanoakrilat yapıştırıcı sürün. Beyin bloğunu dikkatlice tutkal damlasına, rostral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve hemen buz gibi soğuk kesme solüsyonuna daldırın.
- Vibratomun bıçak tutucusunu yatay düzleme göre 15°'lik bir açıya ayarlayın ve 350 μm koronal beyin dilimleri hazırlayın (bıçak titreşim frekansı = 85 Hz, hız = 0,1 mm/s).
- Bir pipet kullanarak, dilimleri ACSF ile doldurulmuş geri kazanım odasına aktarın,% 95 O%2/5 CO2'lik sabit kabarcıklanma ile 1 saat (RT'de) inkübe edin.
>3. Tüm Hücre Yama Kaydı
- Çektirme Kullanım Kılavuzundaki özel yönergelere göre kayıt elektrotları veya puf mikropipetleri olarak kullanmak için cam borosilikat mikropipetler yapın. Elektrotların kaydedilmesi için uç dirençleri 4-6 MΩ aralığındayken, puff mikropipetlerin uç çapları 2-5 μm aralığındadır.
- ACSF'ye hızlı Na+ kanalını ve dolayısıyla aksiyon potansiyellerini bloke etmek için Na+ kanal blokeri (Tetrodotoksin (TTX), 1 μM) ekleyin ve bu çözeltinin kayıt odasında 2-3 mL/dk'lık sabit bir akış hızını koruyun, peristaltik pompa ile hazneye ve aspirasyon. Dilimlerin canlılığını sağlamak için ACSF'yi sürekli olarak %95 O2/5% CO2 ile köpürtün.
- İnce ucu dilim boyutuna uyacak şekilde kesilmiş değiştirilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak bir beyin dilimini kayıt odasına aktarın. Dilimi platformda tutmak için ≥2 mm aralıklı paralel naylon ipliklere sahip bir platin dilim ankraj ile örtün.
- Kayıt mikropipetini dahili çözelti ile doldurun (Tablo 3) ve puf mikropipetlerini 10 μM, 50 μM ve 100 μM'de (ACSF'de çözülmüş) gama-aminobütirik asit (GABA) veya araç kontrolü olarak ACSF ile doldurun.
- Kalıntı ile tıkanmayı önlemek için, kayıt elektrodunu ACSF'ye daldırmadan önce 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hafif pozitif basınç uygulayın. Mikroskop altında bir mikromanipülatör (4x objektif merceği) kullanarak, kayıt elektrodunu ve şişirme mikropipetini, uçlar monitördeki video görüntüsünün merkezinde görünecek şekilde konumlandırın (Şekil 1A).
- Puf mikropipetini kademeli olarak indirirken mikroskop odağını (40x objektif lens) ayarlayın ve 45°'lik bir açıyla kayıt nöronunun üzerine yerleştirin. Puff mikropipetinin ucu ile kaydedilen nöron arasındaki mesafeyi 20-40 μm arasında tutun (Şekil 1B). Kayıt elektrodu ile nörona yavaş ve dikkatli bir şekilde yaklaşın ve ardından pozitif basıncı serbest bırakın. Giga-ohm'luk bir sızdırmazlık oluşturmak için elektrot tutucusuna bağlı borudan zayıf ve kısa bir emme uygulayın.
- Voltajı 0 mV'de tutun. Giga-ohm contasının oluşmasından sonra, hızlı ve yavaş kapasitansı manuel veya otomatik olarak telafi edin. Ardından, tam hücre moduna geçmek için yukarıda belirtilen borudan kısa ve güçlü bir emme uygulayın.
- eIPSC'yi voltaj kelepçesi modunda kaydedin. Tek veya eşleştirilmiş GABA ponponları vermek için bir Master 4 voltaj kademeli jeneratör tarafından kontrol edilen bir Picospritzer kullanarak puf mikropipetine düşük gaz basıncı (nitrojen, 6 - 8 psi) uygulayın (Şekil 2).
Tablo 1. ACSF'yi kaydetme.
adet
adet
| madde | g/mol | Konsantrasyon (mM) | Ağırlık (g/L) |
| NaCl (Doğal) | 58.443 | 119 | 6,9547 |
| Kartal | 74.551 | 2,5 | 0,1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-glikoz | 198,17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110,98 | 2,5 | 0,2775 |
Tablo 2. Dilim kesme çözeltisi.
adet
adet
adet
| madde | g/mol | Konsantrasyon (mM) | Ağırlık (g/L) |
| Kartal | 74.551 | 2,5 | 0,1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0,6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1,25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Kolin·Cl | 139,63 | 115 | 16.0575 |
| D-glikoz | 198,17 | 7 | 1,3872 |
| CaCl2 | 110,98 | 0,5 | 0,0555 |
Tablo 3. Tüm hücre yama kayıtları için dahili çözüm.
)
adet
adet
adet
| madde | g/mol | Konsantrasyon (mM) | Ağırlık (g/L) |
| Cs glukonat | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl (İngilizce | 168,36 | 5 | 0,8418 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 238.301 | 10 | 2,3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0,1904 |
| CaCl2 | 110,98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA Toplantısı | 476.433 | 11 | 5.2408 |
| Na2ATP | 551.1 | 4 | 2.2044 |
| Na2GTP | 523,2 | 0,4 | 0,2093 |
