$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Dış ve İç Çözümler
- Retina diseksiyonu sırasında ve sonraki elektrofizyolojik kayıtta harici çözelti olarak memeli Ringer solüsyonunu kullanın. Memeli Ringer çözeltisini kayıt gününde 10x stok çözeltisinden (kalsiyum olmadan) hazırlayın ve 15 dakikalık karbojenasyondan sonra (% 95 O2 ve% 5 CO2) CaCl2 ekleyin. Son 1x çözelti (mM cinsinden) şunları içerir: 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0.8 Na2HPO4, 0.1NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgS04 ve 10 D-glikoz.
- SAC salınımlarını karakterize etmek için iki dahili çözüm kullanın. Yetişkin fare retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) üzerinde uzun süreli tam hücre yama kelepçesi kayıtlarında hazırlanan çözeltilerin kullanışlılığını test edin ve doğrulanmış partileri kullanıma kadar -20 ° C'de 500 μl'lik alikotlarda saklayın.
- Membran potansiyel salınımını kaydetmek için, (mM cinsinden) içeren potasyum bazlı bir iç çözelti kullanın: 125 K-glukonat, 8 NaCl, 4 adenosin trifosfat (ATP)-Mg, 0.5 Li-guanozin trifosfat (GTP), 5 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 10 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve% 0.2 biyosit (a / h). KOH ile pH'ı 7.3'e ayarlayın.
- Uyarıcı ve inhibitör postsinaptik akımları kaydetmek için, (mM cinsinden) içeren sezyum bazlı bir iç çözelti kullanın: 100 Cs-metansülfonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES ve 0.2% biyosit (a/h). CsOH ile pH'ı 7.3'e ayarlayın.
>2. Kayıt Gününe Hazırlık
- Açık delikli bir nitroselüloz membran hazırlamak için, membranı körelmiş 16 G şırınga iğnesinden yapılmış özelleştirilmiş bir zımba ile manuel olarak delin ve zarı iki temiz cam plaka arasında düzleştirin. Tam montajlı bir retina için, 0,2 mm çapında merkezi bir delik açın ve 1-1,2 mm çapında 4 büyük delikle çevreleyin.
- İç çözeltiyi elektrotlara yüklemek için özelleştirilmiş bir dolgu filamenti yapmak için, ortada 10 μl'lik bir pipet ucunu eritin ve erimiş kısmı soğuyana ve sertleşene kadar hafifçe uzatın. Kullanmadan hemen önce, filamenti yama pipetlerinden biraz daha uzun olana kadar kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın.
- Yama pipetlerini, dahili bir filamente sahip borosilikat cam tüpten programlanabilir bir çektirme içinde çekin. Mikropipetleri deney gününde üretin ve hemen kullanın.
not: SAC'leri kaydetmek için aşağıdaki çektirme ayarını kullanıyoruz: ısı: 484; çekme: 0; hız: 25; gecikme süresi: 1; basınç: 400 ve rampa değeri 462'dir. Borosilikat tüplerin dış çapı (OD) ve iç çapı (ID) sırasıyla 1.65 mm ve 1.0 mm'dir. Pipetlerin direnci 10-14 MΩ'dur.
- Doku hasadından bir saat önce, bir iç çözelti tüpünü >30 dakika boyunca bir girdap üzerinde çalkalayarak çözdürün.
3. Retina Diseksiyonu
- Hayvanı, bir ayak parmağı tutamına duyarlılığını kaybedene kadar oksijende% 4 izofluran ile uyuşturun. Hayvanı servikal çıkık ile kurban edin.
- Her iki göz küresini de optik sinir başlarından 1-2 mm uzakta düz uçlu iris makası ile optik sinirlerden kesin.
- Kanı çıkarmak için gözbebeklerini temiz bir kağıt havlu üzerinde yuvarlayın ve ardından karbonjene memeli Ringer solüsyonuna batırın. 23 G'lik bir iğne ile limbusta bir delik açın ve mikro makasla limbus boyunca keserek gözbebeklerini ikiye bölün. İnce forseps kullanarak korneayı ve lensi çıkarın.
- Retinal tam montaj için, ince forseps ile pigmentli epitelden tüm retinayı nazikçe soyun ve kenardan optik sinir kafasına doğru dört adet 1.5-2 mm ortogonal kesi yapın.
- Delinmiş bir nitroselüloz zarı tabağa daldırın ve retinayı ganglion hücre tabakası (GCL) tarafı yukarı bakacak şekilde yavaşça üzerine sürükleyin. Tam montajlı bir retina hazırlarken optik sinir kafasını ortadaki deliğe yerleştirin. Retina ile zarı başka bir temiz kaba aktarın. Malta haçı gibi görünmesi için retinayı ince bir boya fırçasıyla nazikçe düzleştirin ve dört kenarı da deliklerin üzerine yerleştirin.
- Bir seferde retinanın bir kısmı incelenecekse, Adım 3.3'ten hazırlanan her bir vizör lastiğini, pigmentli epitel kalıntıları bağlı olacak şekilde bir tıraş bıçağıyla 3-4 parçaya kesin. Kullanılmayan parçaları karbonjene harici solüsyonda ışıktan koruyun ve 12 saat içinde kullanın.
- Nitroselüloz membranı bir parça kuru filtre kağıdı ile kurulayın ve camsı ve iç sınırlayıcı membranı forseps ve bir boya fırçası ile çıkarın.
- Düzeneği, altta sızdırmaz bir cam kapak sürgüsü ile kayıt odasına aktarmadan önce tüm retina kenarlarının membrana tam olarak yapıştığından emin olun. Membranı vakumlu gres ile kapak kızağına sabitleyin ve retinayı harici solüsyonla yeniden sulandırın. Tertibatın altına hava kabarcığı sıkıştırmamaya dikkat edin.
- Odayı dik bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Hazneyi ılık (34-35 °C) karbonjene dış çözelti ile dakikada ~ 3 ml oranında perfüze edin.
- Retinayı önce 10x objektif lens altında inceleyin ve ardından diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve/veya epifloresan altında GCL ve iç nükleer tabaka (INL) nöronlarını görmek için 60x suya daldırmalı lens kullanın. tdTomato ifade eden SAC'leri görselleştirmek için, 554 nm'lik bir uyarma filtresi ve 581 nm'lik bir emisyon filtresi ile birlikte bir beyaz ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın.
4. Düz Montajlı Retinadan Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kaydı
- Dahili çözeltiyi bir şırınga filtresinden geçirerek özel dolgu filamentine süzün.
- Filamenti yeni çekilmiş bir mikropipete yerleştirin ve çözelti gümüş elektrot telini >5 mm kaplayana kadar iç çözeltiyi ucun yanına dağıtın. Mikropipeti, tüp bağlantılı 10 ml'lik bir plastik şırınganın pistonunu iterek veya çekerek elektrot içindeki basıncın ayarlanabildiği bir emme kutbuna sahip bir elektrot tutucusuna sabitleyin.
- Objektifin altındaki pipeti bulun ve retinanın ~100 μm üzerine indirin. Akım takip modunda (I = 0), duran DC voltaj sinyalini sıfırlamak için DC ofsetini kullanın. Akım kelepçesi (IKelepçe) modunda, pipet banyodayken pipetten sabit genlikli kare dalga akımları enjekte ederek pipet direncini ölçün ve Raccess düğmesini çevirerek farkı nötralize edin. Ohm yasasına göre pipet direncini hesaplamak için Raccess düğmesindeki okumayı kullanın.
- Elektrodu yavaşça retinanın ~ 10 μm üzerine getirin. Elektroda pozitif basınç uygulayın. Retinaya yaklaşırken pipet ucunun yakınındaki yansıma değişimini izleyin. Pipeti hızlı ama nazikçe GCL'ye doğru itin ve pozitif basıncı hemen azaltın.
- Pipeti etiketli bir nörona doğru hareket ettirin. Diğer nöronlara, kan damarlarına ve Muller hücrelerinin uç ayaklarına temas etmekten kaçının. Elektrot tıkanmasını önlemek için gerekirse daha fazla pozitif basınç uygulayın.
- Pipet ucunu, bir çukur görünene kadar etiketli bir nöronun orta hattına yakın bir yere yerleştirin. Pozitif basıncı serbest bırakın ve plazma zarının pipet ucuna geri sıçramasına izin verin.
- Giga-ohm'luk bir conta oluşumuna yardımcı olmak için pipete 20 ila 120 pA negatif akım uygulayın. Plazma zarını pipete çekmek için gerekirse hafif bir emme uygulayın. Conta oluşumundan sonra hücre zarını yırtmak için 5 dakika bekleyin. Bu, dökülen iç çözeltinin süperfüzyon ile temizlenmesini sağlar. Membranı hafif bir emme ile yırtın.
- Membran yırtılmasından sonra ve mevcut cl modundaykenamp modunda, köprü dengesini açın ve Raccess düğmesini kullanarak ayarlayın.
not: SAC gibi küçük bir hücre için, eğer varsa, sadece küçük bir ayarlama gereklidir. Alternatif olarak, hücreyi sırasıyla klorür (yaklaşık -75 mV) ve glutamat (yaklaşık 0 mV) ters potansiyellerinde tutarak voltaj kelepçesi modunda (VKelepçesi) uyarıcı ve inhibitör postsinaptik akımları kaydedin. Ara sıra retina ve/veya mikromanipülatör kaymasına uyum sağlamak için gerekirse pipet konumunu kontrol edin ve ayarlayın.
- Farmakolojik tedavi öncesinde, sırasında ve sonrasında membran potansiyelini veya akım değişimini kaydetmek için sinaptik blokerler hazırlayın (ör., siyanikisalin [CNQX], (2R)-amino-5-fosfonopentanoat [AP5], pikrotoksin, tubokurarin, vb.) ve kanal modülatörleri (örn., flupirtin, dopamin, meklofenamik asit, vb.) dondurulmuş stoklardan deney gününde taze. İlaçları karbojene Ringer çözeltisi ile seyreltin. Bunları perfüzyon yoluyla toplu olarak uygulayın.
- Kayıttan sonra, pipeti soma dan yavaşça çıkarın. Düzeneği hazneden temiz bir tabağa aktarın. Fiksasyon sırasında retina düzlüğünü sağlamak için retinayı delinmiş delikler olmadan başka bir düzleştirilmiş nitroselüloz membrana ayırın ve yeniden takın.