Birlikte Kültürlenmiş Omurilik Dilimlerinde Nöronal Rejenerasyonları Değerlendirmek İçin Elektrofizyolojik Kayıtlar

Özet

Kaynak: Heidemann, M., et al. Çok Elektrotlu Dizilerde Yetiştirilen Organotipik Omurilik Ko-kültürlerinde Fonksiyonel Rejenerasyonun İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, çok elektrotlu bir dizi veya MEA cihazı kullanılarak yakalanan, omurilik dilimlerinin organotipik ko-kültürlerinden alınan elektrofizyolojik kayıtları sunar. Bu kayıtlar, dilimler arasındaki nöronal rejenerasyonu değerlendirir. Gözlenen senkronize elektriksel aktivite, başarılı nöral rejenerasyonu doğrular.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Omurilik Doku Dilimlerinin MEA'lara Takılması

1. Steril besin maddesini inkübatörde ısıtın (37 °C, oksijenasyon için hafifçe açılmış kapak).
2. Çoklu elektrot dizisini veya MEA'yı, elektrot dizisi odakta olacak şekilde stereo mikroskop altında petri kabında, oda sıcaklığında (RT) kauçuk kaplı uçlara sahip steril cımbızla konumlandırın. 6 μl'lik bir tavuk plazması damlacığını temiz, tozsuz ve steril elektrot dizisi üzerine ortalayın. Küçük bir spatula kullanarak, ventral kenarları birbirine bakacak şekilde iki omurilik bölümünü dikkatlice plazma damlacığına kaydırın. Elektrotlara spatula ile dokunmayın.
3. Tavuk plazma damlacığının etrafına 8 μl trombin ekleyin. Trombin pipet ucunu kullanarak, tavuk plazması / trombin karışımını dikkatlice karıştırın ve iki dilimin etrafına yayın. Yine, kırılgan elektrot dizisine doğrudan dokunmayın. Pıhtılaşmadan hemen önce fazla tavuk plazmasını/trombini aspire edin.
4. MEA/kültür düzeneği 37 °C'de inkübatörün içindeki nemlendirilmiş bir odada yaklaşık 1 saat otururken yüksek nemi korumak için petri kabını kapatın.
5. Kültür odasına dikkatlice 10 μl besin maddesi ekleyin, petri kabını kapatın ve yaklaşık 30 dakika inkübatöre geri koyun.
6. Her bir MEA/kültür düzeneğini steril, kauçuk kaplı uçlarla bir silindir tüpe yerleştirin, 3 ml besleyici ortam ekleyin ve kapağı sıkıca kapatın. Silindir borusunu, 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren bir atmosferde inkübatörde 1 - 2 rpm'de döndürerek silindir tamburuna yerleştirin.
7. Besin ortamının yarısını 7 gün sonra in vitro (DIV) ve daha sonra haftada 1-2 kez değiştirin.

2. Mekanik Lezyonlar

1. Steril, kauçuk kaplı uçlara sahip MEA/kültür düzeneğini silindir tüpünden çıkarın ve doku odakta olacak şekilde stereo mikroskop altında besleyici ortam içermeyen bir petri kabına yerleştirin. İki dilimin kaynaştığını görsel olarak doğrulayın.
2. MEA'nın üzerine kauçuk kaplı uçlara sahip cımbız yerleştirerek MEA/kültür tertibatını sabit tutun.
3. MEA'nın oluğuna doku dilimlerine yakın bir neşter bıçağı yerleştirin. Neşteri oldukça yatay tutun.
4. Neşter sapını yukarı kaldırın, ancak neşter bıçağının, bıçak tabandan uca "yuvarlanacak" ve böylece oluğu kaplayan dokuyu kesecek şekilde MEA'nın oluğunda kalmasına izin verin.
5. Gerekirse 25 G'lik bir iğne ucu ile kalan doku bağlantılarını şiddetlendirin. Sadece oluk içindeki alanda çalışın ve hassas kenarlara dokunmayın.
6. MEA/kültür düzeneğini silindir tüpüne geri koyun. Kültürlere 3 ml taze besin ortamı sağlayın ve bunları inkübatördeki silindir tamburuna geri yerleştirin.

3. Spontan Aktivitenin Elektrofizyolojik Kayıtları

1. Seçilen DIV sayısından sonra iki omurilik dilimi arasındaki fonksiyonel rejenerasyonu araştırmak için, MEA/kültür düzeneğini mikroskopta bir kayıt odasına monte edin ve yaklaşık 500 μl hücre dışı çözelti uygulayın (malzeme listesine bakınız).
2. Sistemin stabilize olmasını sağlamak için ilk kayıttan önce 10 dakika bekleyin.
3. RT'de MEA'nın her aktivite tespit elektrodundan yaklaşık 10 dakika boyunca temel spontan aktiviteyi 2x kaydedin.
4. Kararlı, hücre dışı koşulları sağlamak için, her kayıt oturumundan sonra hücre dışı çözelti alışverişinde bulunun.
5. Ağı engellemek için, striknin (1 μM) ve gabazin (10 μM) içeren hücre dışı bir çözelti uygulayın. Kayda başlamadan önce en az 2 dakika bekleyin.

4. Veri Analizi

NOT: Hücre dışı olarak kaydedilen aksiyon potansiyellerinin tespiti için, standart sapmalara dayalı bir dedektör ve her elektrot için müteakip bir ayırıcı kullanın.

1. Her elektrotun tespit edilen nöronal aktivitesini standart prosedürlere göre bir raster çiziminde görüntüleyin (Şekil 1F).
2. 10 msn'lik kayan bir pencere içinde uygun kanallardaki olay sayısını 1 msn'lik adımlarla kaydırarak özetleyerek her dilim için toplam ağ etkinliğini belirleyin ve görüntüleyin (Şekil 1G).
3. Her dilimde ayrı patlamaları (birkaç elektrotta görünen aktivite kümeleri) tespit edin. Bu nedenle, karşılık gelen toplam ağ etkinliğinde en düşük tepe etkinlik eşiği ayarlayın ve her bir seri çekim başlangıcını ve seri çekim bitişini tanımlayın. Örneğin, uygun bir eşik, ortalama patlama genliğinin %25'idir ve bir seri çekim başlangıcı, en az 5 milisaniyelik bir zaman penceresindeki ilk olay olarak ve bir seri çekim sonu, en az 25 milisaniyelik bir zaman penceresindeki son olay olarak tanımlanabilir.
4. İşlevsel rejenerasyonu ölçmek için, iki dilim arasındaki senkronize patlamaların yüzdesini hesaplayın. Bunu yapmak için, bir dilimdeki bir seri çekim ile diğer dilimdeki bir sonraki seri çekim arasındaki gecikme süresini hesaplayın.
   not: Seri çekim çifti, gecikme süresi ortalama seri çekim uzunluğundan küçük olduğunda "eşitlenmiş" olarak adlandırılır. Özellikle çok fazla aktiviteye sahip ortak kültürlerde, her iki tarafın da seçilen gecikme penceresinde tesadüfen bir patlama başlatma olasılığı vardır. Bu gerçek, senkronize patlamaların yüzdesinin nicelleştirilmesinde dikkate alınmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. Spontan aktivitenin görüntülenmesi ve analizi. (a) Bir MEA'nın diyagramı. Platin kaplı elektrotlar siyah, şeffaf teller kırmızı ve MEA'nın ortasındaki oluk sarı renkle gösterilmiştir. (B) MEA'nın merkezinde bulunan elektrot dizisinin yakın çekimi. (C) 8 DIV eski bir kültürün parlak alan görüntüsü. Dilimler büyüdü ve birbirine bakan kenarlar boyunca kaynaştı. Sarı çubuk, MEA'nın elektrot ve ya...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Düzlemsel çoklu elektrot dizisi	Qwane Biyobilimler		Laboratuvarımızın tasarımına göre ısmarlama
Besin ortamı			100 ml için
Dulbeccos, Eagle'ın ortasını değiştirdi	Gibco (Gibco)	31966-021	80 ml
At serumu	Gibco (Gibco)	26050-070	10 ml
damıtılmış, steril su			10 ml
Sinir büyüme faktörü-7S [5ng/mL]	Sigma-Aldrich	N0513	200 μl
			% 1 BSA ile yıkama çözeltisinde sulandırılır
Hücre dışı matris jel	BD Biyolojik Bilimler	356230	Her zaman soğuk kalmalıdır; doğum öncesi ve embriyonik nöronlar için optimize edilmiş ortam ile 1:50 oranında seyreltin
Hücre dışı çözelti (pH 7.4)			[mM]
NaCl (Doğal)			145
Kartal			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES ÜNİVERSİTESİ			5
Na-piruvat			2
glikoz			5
Gabazin	Sigma-Aldrich	SR-95531
Mikropipet	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	MF28G-5
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532 Serisi	zehirli
Doku kültürü düz tüp 10 (= silindir tüp)	Tekno Plastik Ürünler AG	91243

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi