Tek Boyutlu Desenli Nöronal Kültürlerin Dış Uyarılması

Özet

Kaynak:Stern, S., et al. Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanları Kullanarak Nöronların Dış Uyarılması. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, çizgi desenli nöronal kültürleri tekdüze, tek yönlü bir elektrik alanıyla uyarmak için bir tekniği göstermektedir.

Protokol

1. Floresan boyalarla nöronal kültürlerde spontan veya uyarılmış aktivitenin görüntülenmesi.

1. 50 μL DMSO'da (dimetil sülfoksit) 50 μg kalsiyuma duyarlı floresan boya çözeltisi hazırlayın (Malzeme/Reaktif Tablosuna bakınız).
2. 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glikoz, 45 sükroz (pH 7.4) içeren (mM cinsinden) hücre dışı kayıt çözeltisi (EM) hazırlayın.
3. Nöronal kültürü 2 mL EM'de 8 μL kalsiyuma duyarlı floresan boya çözeltisi ile 1 saat inkübe edin. Işıktan koruyun ve boyanın hücrelere homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için hafifçe döndürün.
4. Görüntülemeden önce çözeltiyi yeni EM ile değiştirin. Floresan görüntüleme Şekil 1'de gösterilmiştir.
5. Kalsiyum floresan görüntüleme için optik filtreli bir floresan mikroskobunda görüntü (488 nm'de uyarma zirvesi, 520 nm'de emisyon zirvesi), mikroskobun görüş alanı içindeki herhangi bir ilgi alanının (ROI) yoğunluğunu ölçebilen bir kamera ve yazılım kullanarak.

2. Kültürlerin Elektrik Stimülasyonu

NOT: Elektrik stimülasyonu için temel kurulum Şekil 2'de gösterilmiştir. Nöronal kültürün yaklaşık 14 gün boyunca büyütüldüğü bir örtü astarı, bir floresan mikroskobu altında bir Petri kabına yerleştirilir. Nöronların elektriksel aktivitesi, kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak görüntülenirken, kültürün dışına yerleştirilmiş iki çift banyo elektrotu aracılığıyla bir voltaj uygulanır. Elektrotlar, çıkışı çift kanallı bir amplifikatör tarafından yükseltilen bir sinyal üreteci tarafından tahrik edilir. Stimülasyon için voltaj kontrolü, daha standart akım kontrolüne göre tercih edilir, çünkü elektrik alan vektörleri doğrudan belirlenir, böylece basit vektör toplama ve kombinasyonu sağlar. Bu, voltaj kontrolü durumunda tüm numune üzerinde gerçekleştirilebilen elektrik alanının tekdüzeliğinin dikkatli bir şekilde kontrol edilmesini gerektirir. Voltaj kontrolünü kullanırken, herhangi bir topraklama döngüsünden kaçınmak için özen gösterilmeli ve elektrik alanının homojenliği doğrulanmalıdır.

1. Homojen bir elektrik alanı ile elektrik stimülasyonu için bir çift paralel elektrot teli kullanın.
   1. 0,005 '' (127 μm) kalınlığında platinden yapılmış elektrotlar kullanın. 13 mm'lik lamellerle kullanıldığında, iki elektrot arasındaki mesafenin yaklaşık 11 mm olduğundan emin olun ve elektrotları kültürün 1 mm üzerine yerleştirin.
      NOT: Elektrot tutucuyu yapmak için (Şekil 3A), politetrafloroetilen (PTFE) kullanın. Elektrotları yerleştirmek için PTFE'de dar delikler açın. Cihaz, hücre dışı çözeltiden daha yüksek olmalıdır, böylece elektrotların maruz kaldığı üst uç asla çözelti ile temas etmeyecektir. İzolasyon için, elektrot uçlarının açıkta kalabilecek herhangi bir yerinde epoksi yapıştırıcı kullanın.
   2. Elektrolizi önlemek için DC bileşeni içermeyen, P görev döngüsüne sahip kare bir darbe şekli kullanın. Kültürü yakmadan etkili stimülasyona neden olmak için nabız süresini 10 μs ile 4 ms arasında değiştirin. Genliğin ± 22 V mertebesinde olduğundan emin olun (bkz. Şekil 3). Kare nabız, elektrotlara paralel bağlanmış bir osiloskop üzerinde gözlemlenebilir.
      not: İstenen herhangi bir dalga formunun kolay programlanması için ticari bir dalga formu düzenleme yazılımı kullanın (Malzeme listesine bakın). İstenen dalga biçimini grafiksel olarak girin ve dalga biçimi üretecine gönderin.
2. Alan homojenliğini test etmek için bir prob elektrodu kullanın. Probun elektrotlar arasındaki alanda hareket etmesine izin vermek ve elektrik potansiyelini ölçmek için en az 1 mm x 1 mm'lik bir ızgara kullanın.
   1. Elektrik potansiyelini ölçün. Elektrik alanını hesaplamak için kullanın. Elektrotlardan birini referans elektrot olarak kullanın. Alanın stimülasyon süreleri aralığında homojen olduğunu doğrulamak için 100 μs ila 4 ms arasında değişen darbe sürelerine sahip elektrik alanını ölçün (100 μs darbe süresi örneği için Şekil 3B'ye bakın).
      not: Darbe süresi 1 ms olduğunda ölçülen bir elektrik alan homojenliği örneği için Şekil 3D'ye bakın.

Sonuçlar

Şekil 1: Senkron ağ patlamaları sırasında görüntülenen kalsiyum geçici akımlarının örnek izleri. Bir. Deneyden önce bir kalsiyum boyası ile boyanmış nöronların bir görüntüsü. B. A'daki ROI'lerin zamana karşı yoğunluk izleri ve A'daki ROI'nin kenarlığının rengini temsil eden izin rengi. Üç ROI içinde senkronize edilen yoğunluktaki büyük bir artış, bir ağ patlamasını temsil eder[Şekil 2...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kalsiyum klorür, 1M	Fluka Çiçeği	21098	Hücre dışı kayıt çözümü.
D- (+) - Glikoz, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Kaplama ortamı, Hücre dışı kayıt çözümü.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Hücre dışı kayıt çözümü.
KCl, 3M	Merck	1049361000	Hücre dışı kayıt çözümü.
Magnezyum klorür, 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Hücre dışı kayıt çözümü.
NaCl, 4M	Biyo-Laboratuvar	19030591	Hücre dışı kayıt çözümü .
Sükroz, 1M	Sigma-Aldrich	S1888 Serisi	Hücre dışı kayıt çözümü.
Elektrotlar teller	A-M Sistemleri, Carlsborg WA	767000	Nöronal kültürlerin elektrik stimülasyonu.
Sinyal üreteci	BK Denetimi	4079	Elektrik sinyalinin şekillendirilmesi.
yükselteç	Ev yapımı		Sinyal üretecinden elektrotlara giden sinyalin voltaj amplifikasyonu.
güç kaynağı	matris	MPS-3005 LK-3	Püskürtme makinesine güç kaynağı.
Platin teller 0.005 '' kalınlığında; A-M Sistemleri,	Carlsborg, WA	767000	Nöronal kültürlerin elektrik stimülasyonu.

Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi adet Serisi