Desenli Nöronal Kültürlerin Manyetik Alan ile Uyarılması

Özet

Kaynak: Stern, S., et al., Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanları Kullanarak Nöronların Dış Uyarılması. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, zamanla değişen bir manyetik alan kullanılarak, bir lamel üzerinde desenli dairesel bir halka içinde büyütülen nöronal kültürlerin uyarılması için bir yöntem gösterilmektedir.

Protokol

1. 1D kültürler için lamellerin hazırlanması.

1. Cam lamelleri 75 mL DDW, 25 mL %25 amonyak çözeltisi ve 25 mL %30 hidrojen peroksitten oluşan bir baz pirana çözeltisine daldırarak temizleyin. Solüsyonu cam lamellerle birlikte ~ 50°C'de 30 dakika boyunca bir ısıtma plakasına yerleştirin ve ardından cam lamelleri nitrojenle kurulayın.
2. İlk olarak, lameller 6 şkalınlığında ince bir krom film (% 99.999) ile kaplanır, ardından buhar veya püskürtme biriktirme kullanılarak 30 şaltın tabakası (% 99.999) ile kaplanır.
   1. 0,05 – 1 ş/s'lik bir püskürtme hızı elde etmek için, 2 e-kirişli bir püskürtme makinesi ve hedef boyutları 2" ve 4" olan 260 l/s'lik bir vakum sistemi kullanın. Dakikada 0 ila 100 tur (RPM) arasında gidebilen bir döndürme aşaması kullanın. 0 ila 750 Watt arasında bir doğru akım (DC) püskürtme gücü kullanın.
   2. Haznede 10 mTorr basınçta plazma elde etmek için cihazı 30 rpm'de döndürün ve% 99.999'da argon kullanın.
   3. Püskürtme tabancalarının güç kaynağını krom için 40 W DC püskürtme gücünde çalıştırın, bu da ~ 0.12 Å/s kapsama oranına ve altın için 10 W DC püskürtme gücünde ~ 0.28 Å/s'ye yol açar.
3. 30 dakika boyunca ultrason kullanarak, 0.1 g 1-oktadekanatiol'ü 100 mL ABS AR etanol içinde çözün. Cr-Au kaplı lamelleri 2 saat boyunca bu çözeltiye yerleştirin, ardından etanol ABS AR ile yıkayın ve nitrojen ile kurulayın.
4. 600 - 700 rpm'de 1 - 2 saat karıştırarak 100 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (D-PBS) ve 3.5 g üç bloklu kopolimerden oluşan bir çözelti hazırlayın (Malzeme / Reaktifler Tablosuna bakınız). Lamelleri 1 saat boyunca çözeltiye yerleştirin. Azotlu kuru lameller.
5. Biyo-reddetme tabakasını çizerek istenen deseni mekanik olarak aşındırın. Bunu, kalemin bir aşındırma iğnesi ile değiştirildiği bir kalem çizici kullanarak yapın. Alttaki cama ulaşmak için deseni metal katmanların arasından çizin. Çoğaltılmış istenen bir desen elde etmek için bu işlemi bir bilgisayar tarafından kontrol edin. Bu işlemle oluşan desenler Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir.
6. 100 mL D-PBS, 3,5 g üç bloklu kopolimer, 35,7 μL/mL fibronektin ve 29 μl/mL lamininden oluşan biyo-uyumlu bir tabaka hazırlayın.
   1. Lamelleri ultraviyole ışıkta en az 10 dakika sterilize edin. Lamelleri hazırlanan biyo-uyumlu solüsyonda gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Biyo-uyumlu katman, yalnızca biyo-reddetme tabakasının önceki adımda kazınmış olduğu yerde oluşacaktır.
   2. Ertesi gün, lamelleri P-DBS ile iki kez yıkayın. Onları gece boyunca PM'de kuluçkaya yatırın. Lameller artık hücre kaplaması için hazırdır.

2. Nöronal kültürlerin bakımı.

1. (mL başına): 0.9 mL MEM + 3G, 0.1 mL HI HS, 10 μL 5-floro-2" -deoksiüridin (FUDR) ile üridin 100x'ten oluşan değişen ortam (CM) hazırlayın.
2. (mL başına): 0.9 mL MEM+3G ve 0.1 mL HI HS'den oluşan son ortamı (FM) hazırlayın.
3. PM'yi 4 gün sonra in vitro (DIV) 1-1.5 mL CM ile değiştirin. 6 DIV'de CM'nin %50'sini yeni CM ile değiştirin. DIV 8'de, ortamı 1.5 mL FM olarak değiştirin, ardından her 2 günde bir% 50 FM değişikliği yapın. Yaklaşık bir hafta sonra spontan senkron aktivite ortaya çıkar.

3. Floresan boyalarla nöronal kültürlerde spontan veya uyarılmış aktivitenin görüntülenmesi.

1. 50 μL DMSO'da (dimetil sülfoksit) 50 μg kalsiyuma duyarlı floresan boya çözeltisi hazırlayın (Malzemeler/Reaktifler Tablosuna bakınız).
2. 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glikoz, 45 sükroz (pH 7.4) içeren (mM cinsinden) hücre dışı kayıt çözeltisi (EM) hazırlayın.
3. Nöronal kültürü 2 μL EM'de 8 μL kalsiyuma duyarlı floresan boya çözeltisi ile 1 saat inkübe edin. Işıktan koruyun ve boyanın hücrelere homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için hafifçe döndürün.
4. Görüntülemeden önce çözeltiyi taze EM ile değiştirin. Floresan görüntüleme Şekil 3'te gösterilmiştir.
5. Kalsiyum floresan görüntüleme için optik filtreli bir floresan mikroskobunda görüntü (488 nm'de uyarma zirvesi, 520 nm'de emisyon zirvesi), mikroskobun görüş alanı içindeki herhangi bir ilgi alanının (ROI) yoğunluğunu ölçebilen bir kamera ve yazılım kullanarak.

4. Kültürlerin Manyetik Stimülasyonu

Not: Manyetik stimülasyon için temel kurulum Şekil 1'de gösterilmiştir. Sağ üstte, nöronlardaki kalsiyuma duyarlı boyaları görüntülemek için kullanılan ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu gösterilmektedir. Manyetik bobin (mavi daireler), bir nöronal halka kültürünün (mavi anahat) üzerine konsantrik olarak yaklaşık 5 mm yerleştirilmiştir. Petri kabının çevresindeki bir toplama bobini (kırmızı daire), manyetik darbenin neden olduğu voltajı izler. Sol üstte, pikap bobininden entegre edildiği şekliyle 5.000 kV kondansatör voltaj yüküne sahip manyetik stimülatör (MS) bobininin ölçülen dinamikleri gösterilmektedir. İndüklenen elektrik alanı (14 mm'lik bir halka yarıçapı için hesaplanmıştır) yeşil renkle gösterilirken manyetik alan mavi renkle gösterilir. Alt kısımda nöronal kültürün görüntüleri gösterilmektedir. Sol altta, desenli 24 mm'lik lamel parlak bir alan görüntüsü yer alıyor. Beyaz alanlar nöronlardır. Fotoğraflanan desen, farklı yarıçaplara sahip eşmerkezli halka kültürlerinden oluşmaktadır. Sağ altta, halkaların kısa bir bölümüne yapılan ve tek tek nöronları gösteren bir yakınlaştırma var. Bir ölçek için, halkaların genişliği yaklaşık 200 μm'dir.

1. 1D kültür stimülasyonu için nöronları dairesel bir halka düzeninde (1.5'te açıklandığı gibi kazınmış) büyütün. İnce (3 μm), uzun (170 mm) çizgiler üzerinde desenli bir 1D kültür ile kalsiyum görüntüleme için kalsiyuma duyarlı bir floresan boya kullanın (bölüm 10'te açıklandığı gibi).
   1. Dairesel bir manyetik bobin kullanın ve bir Petri kabını bobinin yaklaşık 5 mm altına ve bobinle eş merkezli olarak yerleştirin. Maksimum 30 kV voltajla yüklenmiş ev yapımı veya ticari bir MS tarafından tahrik edilen L = 90 mH endüktansa sahip yaklaşık 90 mm (iç çap, 5 mm dış çap) bobinden oluşan özel bir bobin kullanın.
   2. Nöronal kültürleri manyetik olarak uyarmak için, yüksek akım ve akım, yüksek akım-yüksek voltaj anahtarı kullanılarak iletken bir bobin aracılığıyla boşaltılır. Manyetik stimülatör (MS), 1 - 5 kV'luk yüksek bir voltaj elde etmek için 100 mF mertebesinde büyük kapasitörler kullanılarak yapılabilir. Alternatif olarak, piyasada bulunan bir MS kullanın (bkz. Malzeme/Reaktif Tablosu).
      not: Ev yapımı bir bobin imal etmek için 0.254 mm kalınlığında ve 6.35 mm genişliğinde polyester kaplı dikdörtgen bakır tel kullanın. Cam elyafı ile izole edilmiş ve epoksiye dökülmüş özel yapım çerçevelerdeki kabloları çevirin (bkz. Malzeme/Reaktif Tablosu). Alternatif olarak, piyasada bulunan bobinleri kullanın (bkz. Malzeme/Reaktifler Tablosu).

Sonuçlar

Şekil 1: Nöronal kültürlerin manyetik stimülasyonu için kullanılan düzeneğin şeması. Bir. En üstte, nöronal halka kültürünün 5 mm üzerinde eşmerkezli olarak bulunan ve bir Petri kabına (mavi anahat) yerleştirilmiş manyetik bobin (mavi daireler) gösterilmektedir. Petri kabının çevresine yerleştirilmiş bir toplama bobini (kırmızı daire), manyetik darbenin neden olduğu voltajı ölçer. Alt kısımda, manyeti...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CaCl2 , 1M	Fluka Çiçeği	21098	Hücre dışı kayıt çözümü
D- (+) - Glikoz, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Kaplama ortamı, Hücre dışı kayıt çözümü
D-PBS (İngilizce)	Sigma-Aldrich	D8537	Hücre Kültürleri
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F1141	Biyo Kaplama
Fluo4,	Yaşam teknolojileri	F14201	Spontan veya uyarılmış aktivitenin görüntülenmesi
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Ortam değiştirme
Gentamisin	Sigma-Aldrich	G1272	Kaplama ortamı, Değişen ortam, Son ortam.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Hücre dışı kayıt çözümü
MERHABA HS	biseksüel	04-124-1A	Kaplama ortamı, Değiştirme ortamı, Son ortam
KCl, 3M	Merck	1049361000	Hücre dışı kayıt çözümü
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Biyo Kaplama.
MEM x 1	Gibco (Gibco)	21090-022	Kaplama ortamı, Değiştirme ortamı, Son ortam
Magnezyum klorür, 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Hücre dışı kayıt çözümü
NaCl, 4M	Biyo-Laboratuvar	19030591	Hücre dışı kayıt çözümü
Oktadekanetiyol	Sigma-Aldrich	1858	Cr-Au kaplı lamellerin temizlenmesi (1D kültürler)
Sükroz, 1M	Sigma-Aldrich	S1888 Serisi	Hücre dışı kayıt çözümü
üridin	Sigma-Aldrich	U3750	Ortam değiştirme
Püskürtme makinesi	AJA Uluslararası, Inc	ATC Orion-5 Serisi	Camın ince metal tabakaları ile kaplanması
Kalem çizici	Hewlett Packard ·	HP 7475A Serisi	Desenin kaplanmış lamel üzerine aşındırılması
güç kaynağı	matris	MPS-3005 LK-3	Püskürtme makinesine güç kaynağı
Epoksi	Biliş	Versamid 140	Ev yapımı bobinlerin dökümü
Epoksi	kabuk	EPON 815	Ev yapımı bobinlerin dökümü

Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Yılı Gazetesi Serisi Gazetesi Yapımı Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Serisi