3D Kokültür Kürelerinde Sinaptik Fizyolojiyi Ölçmek için Çoklu Elektrot Dizilerinin Kullanılması

Özet

Kaynak: Cvetkovic, C., et al. İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Astrositlerin ve Nöronların 3D Kokültürleri ile Sinaptik Mikro Devre Modellemesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, 3B kokültür kürelerinde sinaptik fizyolojiyi ölçmek için çoklu elektrot dizisinin (MEA) kullanılması prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, 3B küreler içindeki sinir ağı dinamiklerini ve sinaptik ağ patlama aktivitesini anlamayı sağlar.

Protokol

Çok Elektrotlu Dizilerle (MEA'lar) Canlı Sinaptik Fizyolojinin Ölçümü

>1. MEA'ları hücre kültürü için hazırlayın.

1. Her MEA'nın yüzeyini 1 saat boyunca 1 mL deterjanla temizleyin. Steril deiyonize (DI) su ile durulayın, sterilize etmek için %70 etanol ile durulayın ve ardından UV ışığı altında bir biyogüvenlik kabininde havayla kurutun.
   not: MEA'lar, kullanılana kadar steril koşullar altında 4 °C'de DI suda saklanabilir.
2. 50 mg PLO'yu 100 mL borik asit tamponu içinde çözerek 0.5 mg / mL'lik bir poli-ornitin (PLO) çözeltisi hazırlayın. Her MEA'nın yüzeyini hidrofilik hale getirmek için 1 mL PLO ile kaplayın ve en az 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. PLO'yu çıkarın ve yüzeyi DI suyla yıkayın.
3. 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için hücre dışı matris (ECM) kaplama çözeltisini bazal (DMEM / F12) ortamla seyreltin. Çalışan bir çözelti için, 3 mL ECM stoğunu 33 mL önceden soğutulmuş DMEM/F12 ortamına yeniden süspanse edin ve toplam hacmi 80 μg/mL'lik bir konsantrasyon için 36 mL'ye getirin.
4. Her MEA'ya 1 mL ECM çalışma solüsyonu ekleyin ve 37 °C'de en az 4 saat inkübe edin.
5. ECM'yi çıkarın ve küreleri bir MEA yüzeyi üzerinde 1,5 mL ortama yerleştirin, böylece kürelerin elektrot dizisinin üzerine yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 1A, 1A'). Medyanın 2 gün yapışmasına izin verin. Ortamın yarısını her 2-3 günde bir (veya gerekirse daha sık) değiştirerek kürelerin rahatsız edilmemesini sağlayın.
   not: Büyüme faktörlerinin eklenmesi kültürün sağkalımını ve olgunlaşmasını iyileştirebilir.

2. Nöral kürelerin elektriksel aktivitesini ölçün.

1. Sıcaklık kontrollü bir ana tablaya sahip bir çoklu elektrot dizisi (MEA) sistemi kurun. 5 Hz yüksek geçiren filtreye, 200 Hz alçak geçiren filtreye ve 5x standart sapma (SD) ani yükselme eşiğine sahip bir yazılım programı oluşturun.
2. MEA'yı baş üzerine yerleştirintage ve spontan elektriksel aktiviteyi kaydedin (Şekil 1B, B'). İstatistiksel analiz için ani yükselme frekansı ve genlik dahil olmak üzere ham verileri kaydedin.
   not: Farmakolojik ajanlar eklemek veya uzun süreli kayıt için taze ortam akışını artırmak için MEA ile bir perfüzyon sistemi kullanılabilir. İstendiği gibi, sivri uçların ek işlenmesi gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Çok elektrotlu diziler (MEA'lar) üzerindeki nöral kürelerin temsili canlı sinaptik fizyolojisi. (A, A') MEA'lar, nöral kürelerin canlı sinaptik fizyolojisini ölçmek için kullanılır. iNeuron'ların (A) küreleri veya iNeuron'ların ve hAstros'un (A') kokültürleri, ECM'yi taklit eden substratlarla MEA yüzeylerinde kültürlenebilir (bkz. adım 4.1). (B, B') Bir kayıt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM/F12	Termo Balıkçı	10565-042	GlutaMAX takviyesi ile
Anti/anti	Termo Balıkçı	15240062
B27	Termo Balıkçı	17504044	Medya Eki
Heparin	Sigma	H3149-50KU	Çalışma konsantrasyonu: 2 mg / mL
Matrigel membran matrisi	Corning	354230	ECM kaplama çözümü. Çalışma konsantrasyonu: 80 ug / ml. Buz üzerinde hazırlayın ve pipetlerin, tüplerin ve ortamın önceden soğutulduğundan emin olun.
MEA 2100 Sistemi	Çok Kanallı Sistemler	MEA2100
N2	Termo Balıkçı	17502048	Medya Eki
Poli-l-ornitin (FKÖ)	Sigma	P3655-100MG	Çalışma konsantrasyonu: 0.5 mg / mL