$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İki Fotonlu Lazer Mikroskobu Kullanılarak Bir Nöron Alt Popülasyonunun Ablasyonu
NOT: Kullanıcılar ablasyondan sonra Ca görüntüleme yapmayı planlıyorsa, UAShspzGCaMP6s satırını kullanın. Kullanıcılar ablasyondan sonra davranışsal kayıt yapmayı planlıyorsa, EGFP pozitif hücrelerin ablasyonunun gerçekleştirilmesi GCaMP6s eksprese eden hücrelerden daha kolay olduğu için UAS: EGFP hattını kullanın.
- Çalışılacak belirli nöronları ve UAS: EGFP veya UAShspzGCaMP6'ları etiketleyen bir Gal4 hattının eşleşmesini ayarlayarak başlayın. Sedef homozigotlarının elde edilebilmesi için her iki ebeveyn için de sedef arka planını kullandığınızdan emin olun.
not: Sedef homozigotları vücut yüzeyinde melanofor içermez (Şekil 1B). Bu çalışmada, bir Gal4 hattı gSAIzGFFM119B (pretektumu etiketler) ve başka bir Gal4 hattı hspGFFDMC76A (ILH'yi etiketler) kullanılmıştır.
- Çiftleşme düzeneğinin ertesi gününde, zebra balığı yumurtalarını toplayın ve onları larva aşamasına yükseltin, bu noktada ilgilenilen nöronlar floresan muhabirleri ifade edecektir.
- Zebra balığı larvalarını %2 düşük erime noktalı agaroza monte edin (Şekil 1B).
- % 2'lik bir agaroz stok çözeltisi hazırlayarak başlayın: 2 g düşük erime noktalı agaroz tozunu 100 mL sistem suyunda (yani, dolaşan bir su sisteminde yetişkin zebra balığını korumak için kullanılan su) veya E3 suyunda, suyu bir mikrodalgada kaynama noktasına kadar ısıtarak ve kuvvetlice karıştırarak çözün.
- %2 düşük erime noktalı agaroz stoğunu kaynayana kadar mikrodalgada ısıtın. 3.5-4.0 mL agarozu 6 cm'lik bir Petri kabının kapağına dökün. Devam etmeden önce agarozun soğumasını bekleyin, böylece dokunulamayacak kadar sıcak olur.
- Daha sonra, agarozun içine tek bir larva (bu adımda anestezi uygulanmamış) yerleştirin. Larvaların uygun şekilde konumlandırılmasını sağlamak için agaroz katılaşana kadar bir diseksiyon iğnesi (Şekil 1C) kullanarak larvaların konumunu ve yönünü dik olacak şekilde ayarlamaya devam edin.
not: Agaroz katılaşırken larva etrafta yüzmeye devam edecektir.
- Larva yerleştirildikten sonra, agarozun tamamen katılaşması için 5 dakika bekleyin.
- Agarozun üzerine 5 mL trikain çözeltisi (1x çalışma konsantrasyonunda% 0.4) dökün.
not: Lazer ablasyon sırasında larvaların hareketlerini önlemek için, larvalar ablasyon prosedürü boyunca uyuşturulmalıdır.
- İki fotonlu lazer mikroskobu sisteminde ağartma fonksiyonunu kullanarak larvaları ayıklayın.
- Agaroz gömülü larvaları iki fotonlu lazer tarama mikroskobu altına yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın.
- Görüntü alma yazılımını başlatın ve lazeri açmak için "Lazer" sekmesindeki "Açık" düğmesine tıklayın (Şekil 1D). Lazerin "Durumu"nun "Meşgul"den "Mod kilitli"ye değişmesini bekleyin.
- "Kanallar" sekmesinde, lazerin dalga boyunu EGFP ablasyonu için 880 nm'ye (maksimum güç: yaklaşık 2.300 mW) veya GCaMP ablasyonu için 800 nm'ye (maksimum güç: yaklaşık 2.600 mW) ayarlayın.
- Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 20X objektif lensini seçin. "Bul" sekmesine tıklayın, optik yolları değiştirmek için "GFP"ye tıklayın ve floresansı doğrudan gözle görüntüleyin.
- Görünümün merkezinde zebra balığı larva beynini bulun; ardından iki foton mikroskobuna geri dönmek için "Edinme" sekmesine tıklayın.
- 'Ablasyon öncesi' durumunun bir kaydı olarak, 20X objektif lensi ile yüksek tarama hızında (ısı hasarını önlemek için) bir z-stack görüntüsü çekin. Daha sonra ablasyon deneylerinden önce ve sonra çekilen görüntüleri karşılaştırın (Şekil 2A). Bir z-yığını elde etmek için, z-yığını seçeneğini seçmek ve sekmeyi genişletmek için "Z-Yığını"na tıklayın. Larva beyninin ventral ucuna odaklandıktan sonra alt sınırı ayarlayın ("Önce Ayarla" düğmesine tıklayın) ve beynin dorsal en yüzeyine odaklandıktan sonra üst sınırı ayarlayın ("Sonuncuyu" düğmesine tıklayın). Ardından, z-stack görüntü alımını çalıştırmak için "Denemeyi Başlat" düğmesini tıklayın.
- Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 63X objektif lensini seçin.
- Epi-floresan mikroskobuna geçmek için "Bul" sekmesine tıklayın, görüş merkezinde gözle kesilecek hücreleri bulun, ardından lazer tarama mikroskobuna geri dönmek için "Edinme" sekmesine tıklayın.
- "Edinme Modu" sekmesinde, "Çerçeve Boyutu" nu 256 x 256 olarak ayarlayın. "Canlı" yı tıklayın ve ilgilendiğiniz nöronları gözlemleyin.
- En sırt tarafından başlayarak, ablasyon yapılacak hücrelerin odakta olduğu bir odak düzlemi bulun.
- "Bölgeler" işlevini kullanarak, her bir nöronda hücre boyutunun yaklaşık üçte biri kadar hücre boyutunda küçük, dairesel bir alanı ilgi alanı (ROI) olarak işaretleyin.
- Tarama hızını 13,93 sn/256 x 256 piksel (134,42 μm x 134,42 μm) olarak ayarlayın, bu da yaklaşık 200 μs/piksel veya 200 μs/0,5 μm'lik bir lazer bekleme süresine karşılık gelir. Ayrıca, 4 tekrar ayarlayın ('Yineleme döngüsü: 4'). Alternatif olarak, yeterli ablasyon elde etmek için yineleme sayısını ve tarama hızını optimize edin.
- Numuneyi (ablasyondan önce ve sonra) ve 'Bölgeler'i (ROI'leri ayarlamak için) veya kullanılan yazılımdaki eşdeğer işlevleri görüntülemek için 'Zaman serisi (2 döngü)' ile birlikte ablasyon için 'Ağartma' işlevini gerçekleştirin (Şekil 1D).
- Zaman serisi döngüsünde ilk görüntüyü (ablasyondan önce) ve ikinci görüntüyü (ablasyondan sonra) karşılaştırarak, ağartmadan sonra hedeflenen hücrelerdeki floresansın arka plan seviyesinde gözlemlenene düştüğünden emin olun (Şekil 2B).
- Ablasyondan sonra floresan hala mevcutsa, yineleme sayısını artırın.
- Ardından, odak düzlemini biraz daha derine (yani ventral tarafa doğru) hareket ettirin ve ablasyona uğramamış hücrelerin göründüğü bir sonraki odak düzlemini seçin.
- Ağartma işlevini yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin (adım 1.9). İlgilenilen nöral yapıdaki tüm hücreler kesilene kadar bu adımları tekrarlayın.
- Ablasyon yapılacak nöral yapıları kaplayan tüm odak düzlemlerinden geçtikten sonra, hücrelerde ortadan kaldırılmış floresan olup olmadığını kontrol edin. Yetersiz ablasyon nedeniyle bazı hücrelerin hala floresan olduğu tespit edilirse, yukarıda açıklandığı gibi tekrar lazerle ışınlayın.
- Lazer ışınlamasından sonra larvaların agarozdan kurtarılması gerekiyorsa, larvaya zarar verebileceği için onu agarozdan çıkarmaya çalışmayın. Bunun yerine, larvanın etrafındaki agarozda vücudunun yüzeyine dik olarak dikkatlice küçük kesikler yapın. Ardından, anestezik yıprandığında larvaların agarozdan kendi kendine yüzmesini bekleyin.
- Ablasyon için bir sonraki larvaya geçin veya araştırılan davranışa dahil olmayan başka bir nöron popülasyonu kullanarak kontrol deneyleri yapın.
not: Burada, bir kontrol olarak, UAS:EGFP'deki koku alma ampulü nöronları; gSAIzGFFM119B larvaları, yukarıda açıklanan aynı protokol kullanılarak lazerle ablasyon yapıldı (Şekil 2A, sağda).
- Ca görüntülemeye (Bölüm 2) veya davranışsal kayda (Bölüm 3) geçmeden önce iyileşme için birkaç saat veya 1 gün bekleyin. Bu iyileşme süresi boyunca, larva sağlığını kontrol edin (yani, normal spontan yüzme, ablasyon alanı çevresinde belirgin bir ısı hasarı yok, vb.) ve herhangi bir kötü sağlık belirtisi gösteren larvaları çıkarın.
2. Pretektum ile Ablasyonlu Zebra Balığı Larvalarında Av Tarafından Uyarılan Nöronal Aktiviteyi Kaydetmek için Kalsiyum Görüntüleme
- Bir kayıt odası hazırlamak için, yapışkan tarafı cama bakacak şekilde bir cam kızak üzerine güvenli sızdırmaz bir hibridizasyon odası contası yerleştirin ve üst contayı çıkarın.
not: Bu, 9 mm çapında ve 0.8 mm derinliğinde küçük bir kayıt odası oluşturur (Şekil 3A).
- Ardından, alt kısmı açık olan 50 mL'lik bir tüpe naylon bir ağ (açıklık boyutu: 32 μm) yerleştirin. Ağı tüpe takmak için kapağı kullanın (Şekil 3B).
- Paramecia'yı (larva için görsel uyaran olarak kullanılacak av olan) hazırlayın.
not: Paramecium kültürünü (adım 2.3.1 ve 2.3.2) önceden hazırlayın.
- Paramecia tohum kültürünü ticari kaynaklardan veya akademik biyo-kaynak merkezlerinden önceden temin edin.
- Paramesyumu otoklavlanmış pirinç samanı ve bir miktar kuru bira mayası içeren suda birkaç gün boyunca kültürleyin (Şekil 3C).
- Kültürdeki kalıntıları temizlemek için paramesyum kültürünü art arda 2 elekten (biri 150 μm açıklı, ardından diğeri 75 μm açıklıklı) dökün.
- Bir naylon ağ (13 μm açıklık) üzerinde önceki adımdan itibaren akıştaki parameciaları toplayın.
- Naylon ağ üzerindeki paramecia'yı bir şişe sistem suyu sıkarak bir cam behere yeniden süspanse edin (Şekil 3D).
- Ağı (Şekil 3B) sistem suyunda 2x (Şekil 3E) durulayın.
not: Bu adımın amacı, bu çalışmanın amacı görsel olarak yönlendirilen nöronal aktiviteyi gözlemlemek olduğundan, paramesyum kültür ortamında bulunan olası koku ve tatları uzaklaştırmaktır.
- Anestezi yapmak için tricaine solüsyonuna bir zebra balığı larvası yerleştirin.
- % 2 düşük erime noktalı agarozda tek bir larva monte edin.
- İlk olarak, %2 düşük erime noktalı agarozu mikrodalgaya koyun ve agaroza 1/10 hacimce 10x konsantre trikaya ekleyin.
- Trikat içeren agarozdan bir damla kayıt odasına yerleştirin (Şekil 3A).
- Agarozun çok sıcak olmadığını onayladıktan sonra, anestezi uygulanmış larvaları (2.5. adımdan itibaren) agarozun içine yerleştirin, fazla agarozu hemen çıkarın, böylece agarozun yüzeyi hafif dışbükey görünür.
- Larvaları bir diseksiyon iğnesi ile hızlı bir şekilde dik konuma getirin (Şekil 1C).
not: Bu prosedürler, agaroz katılaşmadan önce birkaç saniye içinde tamamlanmalıdır.
- Larva düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, agarozun tamamen katılaşması için 5 dakika bekleyin. Ardından, agarozun üzerine bir damla 1x tricaine solüsyonu dökün.
- Zebra balığı larvasının başının etrafındaki agarozu çıkarın ve paramesyumun cerrahi bir bıçak kullanarak yüzmesi için yer açın. Bunu yapmak için önce agarozda birkaç küçük kesik yapın (Şekil 3F). Ardından, hazneye sistem suyunu hafifçe dökerek fazla agarozu dikkatlice çıkarın.
not: Bu adımda, tricaine yıkanacaktır.
- Ardından, görsel bir uyaran olarak hizmet etmesi için kayıt odasına bir paramesyum koyun.
not: Paramesyum, zebra balığı larvalarının başının yakınında yüzdüğünde, nöronal bir tepki uyandıracaktır (Şekil 3G).
- Kayıt odasını bilimsel bir CMOS kamera (Şekil 3H) ile donatılmış bir epi-floresan mikroskobunun altına yerleştirin ve 2.5X objektif lens seçin (Şekil 3I).
- GCaMP floresan sinyallerinin hızlandırılmış kayıtlarını toplayın.
- Donanımlı kamera için görüntü alma uygulamasını başlatın.
- "Sıra Bölmesi"ne tıklayın ve bölmede "Sabit Disk Kaydı"nı seçin. Tarama Ayarları bölümünde, "Çerçeve Sayısı"nı 900 veya istenen başka bir toplam kare sayısına ayarlayın.
not: Varsa, verilerin bir sabit sürücüye verimli bir şekilde kaydedilmesini sağlayan bir modüle (burada "Sabit Disk Kaydı") sahip hızlandırılmış kayıt yazılımı kullanın.
- "Yakalama" bölmesinde, pozlama süresini 30 ms (yani 33,3 fps) ve Binning 2 x 2 olarak ayarlayın.
- Mikroskobu kontrol eden dokunmatik panelde, GCaMP'nin GFP'ye benzer uyarma/emisyon spektrumlarına sahip olması nedeniyle GFP için bir filtre seti seçin.
- Kamera görünümünde larvayı bulmak ve odaklamak için Yakalama bölmesinde "Canlı"ya tıklayın (Şekil 4A) ve ardından "Canlıyı Durdur"a tıklayın ve "Başlat" düğmesine tıklayın. Filmi .cxd biçiminde veya alma koşulu hakkında bilgi içeren başka bir biçimde kaydedin.
