$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Elektrofizyoloji
>NOT: Bu protokolün amacı, GFP elektroporasyonlu fare beyinlerinde (veya daha önce elektroporasyonlu başka herhangi bir floresan proteinde) GFP ekspresyonu ile görsel olarak tanımlanan katman II/III piramidal hücre nöronlarından tam hücre akım kelepçesi kayıtları elde etmektir. Bu protokolü kullanarak, İEÜ tarafından getirilen bir genetik modifikasyonun nöronun elektriksel özellikleri üzerindeki etkisini incelemek mümkündür. Spesifik ateşleme modlarının elde edilmesi, geniş bir iyon kanalı repertuarının dinamik ifadesini içeren ve geç doğum sonrası aşamalardan önce geçici ateşleme modlarının ekspresyonu ile sonuçlanan kademeli bir farklılaşma sürecidir. Örneğin, P16'dan önce somatosensoriyel fare korteksinin II/III katmanlarında olgun elektriksel tepkiler gözlenmez.
- Akut dilimler için ön koşullar
- 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM glikoz, 2.5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2 ve 1 mM NaH2PO4 içeren yüksek saflıkta (çift damıtılmış su) kullanarak 1 L ACSF hazırlayın. HCl veya NaOH ile pH'ı 7.3 - 7.4'e titre edin. Ozmolariteyi 290 mOsm'ye ayarlayın.
- PH'ı 7.3 - 7.4'e stabilize etmek için Teflon tüpler (~ 1 mm) kullanarak 15 - 20 dakika boyunca karbojen (% 95 O2/% CO2) ile kabarcık ACSF.
- Tüm hücre kaydı için ön koşullar
- Elektrofizyoloji istasyonunun bir kayıt odası, bir perfüzyon sistemi, bir mikroskop, elektrotlar (kayıt, uyarıcı ve toprak), makro ve mikro manipülatörler, sert bir titreşime dayanıklı masa üstü ve Faraday kafesi, bir stimülatör, bir amplifikatör ve analogdan dijitale (A/D) dönüştürücü, edinme yazılımına sahip bir bilgisayar ve genetiği değiştirilmiş nöronları analiz etmek için bir GFP (veya başka bir florokrom) filtresi ile donatıldığından emin olun (Şekil 1A).
- 115 mM potasyum glukonat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mMNa2ATP ve 0.3 mMNa3GTP içeren, KOH ile pH 7.2'ye ve KCl ile 290 mOsm'ye ayarlanmış hücre içi çözeltiyi hazırlayın.
- Borosilikat cam kılcal damarları çekerek yama pipetleri yapın. Bir mikropipet çekicisi kullanarak yama elektrotlarını hazırlayın. Borosilikat kılcal damarlar kullanın (1,5 mm dış çap, 0,86 mm iç çap, 10 cm uzunluk). Hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 3-10 MΩ direnç gösteren yama elektrotları yapın.
- Kayıt odasını ACSF ile 2 mL/dk hızında perfüze edin. Odanın sıcaklığını yaklaşık 33 °C'de tutun.
- Tam hücre kaydı
- Dilimleri bir Pasteur pipeti (uzun ucu kesin) veya küçük bir fırça kullanarak kayıt odasına aktarın. Dilimi bir arp ile basılı tutun. Dilimleri ACSF ile sürekli olarak 2 mL / dk hızında perfüze edin.
- GFP pozitif bir nöronu yamalayın.
- Dilimi kayıt odasına koyun ve düşük büyütme oranıyla (10X) mikroskop aracılığıyla ilgilendiğiniz alanı bulun. Ardından, 60x hedefini kullanarak yama yapmak için GFP pozitif bir hücre bulun.
- Kayıt elektrodunu hücre içi çözelti ile doldurun. Kayıt elektrodunu hücre içi solüsyonla doldurmak için filtreye (4 mm filtre) ve mikro yükleyici ucuna bağlı şırıngayı kullanın.
- Cam pipeti pipet yuvasına yerleştirin. Pipet ucunu banyoya yerleştirin ve uca odaklanın. Pipet banyoya girdikten sonra, geri basınç kontrol sisteminden pozitif basınç uygulayın.
- Floresan olan bir nöronu yamalayın (Şekil 1B).
- Pipetteki geri basıncı korurken görsel rehberlik altında ilgilendiğiniz hücreye yaklaşın. Hücre yüzeyinde küçük bir çukur ortaya çıktığında, basıncı serbest bırakın. Bu noktada, sıkı bir sızdırmazlık (1 GΩ'dan büyük direnç) oluşabilir. Aksi takdirde, kolaylaştırmak için hafif bir negatif basınç (emme) uygulayın.
- Conta oluşturulurken, tutma voltajı kelepçesini -60 mV'a getirin. GΩ contası oluşturulduktan sonra, pipetin altındaki hücre zarını yırtmak için bir emme darbesi uygulayın ve tam hücre moduna geçin.
- Akım-kelepçe koşullarını kullanarak etkinliği kaydedin. Tam hücre modundayken, voltaj-kelepçeden akım-kelepçe moduna geçin ve kayda başlayın. Örneğin, hücre uyarılabilirliğini kaydetmek için 500 ms uzunluğunda depolarize edici akım enjeksiyonları (100 - 400 pA) uygulayın.
- Artan giriş akımları için tren boyunca aksiyon potansiyellerinin sayısını çizerek ateşleme hızlarını hesaplayın.
not: Dinlenme membran potansiyeli, giriş direnci ve membran kapasitansı da kayıtlardan hesaplanabilir.
