Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Domuz Yavruları ve Domuz Yavrusu Kullanımı
- ARRIVE yönergelerine uygun olarak olası cinsiyete dayalı karışıklıkları ortadan kaldırmak için erkek ve dişi domuz yavrularını sistematik ve rastgele bir şekilde kullanın.
NOT: Maksimum beyin büyümesi periyodu domuz yavrusu doğumundan sonraki 3-5 gün içinde olduğundan, deney sadece 3-5 günlük domuz yavruları ile yapılır.
- Çevreye alışmalarını sağlamak için domuz yavrularının deneyden en az 24 saat önce vivaryuma ulaştığından emin olun.
not: Eğitimli veteriner personeli rutin hayvan bakımı sağlar. Domuz yavruları, bireysel olarak sıcaklıkta tutulan, sürekli izlenen kafeslerde tutulur ve hipoglisemiyi önlemek için besinsel olarak eksiksiz bir süt ikamesi ad libitum alır. Domuz yavruları ayrıca anesteziden en az 3 saat önce süt replasmanı yapılmadan (os başına sıfır) tutulur ve normal stimülasyon seviyelerini sağlamak için battaniyeler ve oyuncaklarla birlikte verilir. Mümkünse, sosyalleşmeye izin vermek için birden fazla domuz yavrusunu aynı kafeste tutun.
2. Bir Piglet Modelinde Anesteziye Bağlı Nörotoksisite (AIN) Çalışmaları için Mikroelektrot Dizilerinin (MEA'lar) Geliştirilmesi ve Özelleştirilmesi
NOT: Bu teknoloji, enzimle önceden kaplanmış ve m-fenilendiamin dihidroklorür (mPD) ile elektrolizle kaplanmış enzim bazlı MEA'ları kullanır. Elektrotlar, 40 mm'lik sert bir şaft ile özel olarak tasarlanmış ve domuz yavrularında kullanılmak üzere üretilmiştir (Şekil 1).
- Lütfen MEA hazırlama ve kalibrasyonunun ayrıntılı açıklamasına bakın (Şekil 2).
3. Domuz yavrusu için anestezi ve özel stereotaksik aparat kullanımı
- Uygun bir ventilatör ve izleme cihazlarına sahip bir anestezi iş istasyonu kullanarak hayvanları uyuşturun ve daha önce açıklandığı gibi deneyin tamamı boyunca nabız oksimetresi, non-invaziv kan basıncı, elektrokardiyografi ve sıcaklık gibi fizyolojik parametreleri izleyin. Domuz yavrularını entübe edin ve havalandırın ve 3.5 saat boyunca 1 minimum alveolar konsantrasyonda (MAC) (yaklaşık% 2.5-3) sevofluran anestezisi uygulayın. Bu deneyler için eğitimli laboratuvar personelinin hazır bulunmasını sağlar. Cerrahi alanı kaplayan kürk, cilt hazırlanmadan önce elektrikli makas kullanılarak çıkarılır.
not: Kullanılan anestezinin konsantrasyonu ve süresi, deneyin bir cerrahi prosedür sırasında gerçek anesteziye maruz kalma süresini simüle etmesine izin verir. Ek olarak, sevofluran, pediatrik popülasyonda en sık kullanılan genel anesteziktir ve güvenliğini çevreleyen araştırmayı son derece önemli hale getirir.
- Stereotaksik çerçeveye yerleştirmeden önce, çerçevede sabitlenirken hayvan hareketini önlemek için 2.5 mg / kg'lık bir roküronyum yükleme dozu ve 1.5 mg / kg / s'lik bir infüzyon başlatın.
- Parmak parmağı kıstırma ile yeterli bir anestezi derinliği onaylandıktan sonra domuz yavrusunu domuz yavrusuna özgü stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- Basınç ülserlerini önlemek için domuz yavrusunu ek dolgulu (örn. akışkanlaştırılmış konumlandırıcı) bir cebri hava ısıtma pedi üzerine yerleştirerek stereotaksik çerçeve içinde yeterli dolgu sağlayın.
- Üst mandibulanın dişlerini diş çubuğunun üzerine yerleştirin (Şekil 3).
not: Diş çubuğu, kafatasını çok sıkı bir şekilde yerinde tutmak için yeterli seviyede olmalıdır.
- Domuz yavrusunun orta hat konumunda olduğundan emin olarak, nüfuz eden kulak çubuklarını kulakların içine sabitleyin ve sıkın. Yanal tutucuların sivri uçlarını kulak kanalının içine yerleştirin ve kulak çubuklarını, kulak zarının penetrasyonuyla ilişkili "pop" sesini duyacak kadar sıkı bir şekilde yerleştirin. Deney sırasında kafatasının hareket etmesini önlemek için kulak çubuklarını kafatasına sıkıca takın ve her iki tarafta eşit derinlikte yerleştirin (Şekil 4, Panel A).
not: Domuz yavrusunu sıcak tutmak (~ 37.8-38.6 °C) ve normoterminin bakımı için tüm prosedür boyunca sıcaklığı sürekli olarak izlemek hayati önem taşır. Bu, bir battaniye ve/veya bir ısı lambası ile gerçekleştirilebilir. Hayvanın derisinin yanmasını önlemek için ısı lambasını uygun bir mesafeye yerleştirdiğinizden emin olun.
- Kafatasını neşterle çizmekten kaçınmak için dikkatli kullanarak kafatası boyunca 4-6 cm'lik bir orta hat kesisi oluşturun. Kesi yapıldıktan sonra, kafa derisini kafatasından kaldırmak için hafif retraksiyon ve künt diseksiyon kullanın. Herhangi bir bağ dokusunu çıkarmak ve dikiş çizgilerini ortaya çıkarmak için kafatasını bir gazlı bezle nazikçe ovalayın (Şekil 4, Panel B).
not: Hayatta kalmayan deneyler sırasında steriliteyi korumak gerekli değildir. Bununla birlikte, hayatta kalma deneyleri sırasında sterilite korunmalıdır.
- Gerekirse, ilgilenilen alanı ortaya çıkarmak ve kraniyotomi için amaçlanan yeri belirlemek için kafa derisini daha fazla yansıtın (Şekil 5, Panel A). İlgili yapının üzerinde yaklaşık 0,25cm2'lik bir kraniyotomi penceresi oluşturmak için cerrahi bir matkap kullanın (deneysel hedeflere bağlı olarak daha büyük veya daha küçük olabilir), duraya veya altta yatan beyne zarar vermemeye dikkat edin (Şekil 5, Panel B). Beyin dokusunun üzerindeki durayı çıkarmak için ince cerrahi makas kullanın (Şekil 5, Panel C).
- Elektrodu, başlığın metal kolunu domuz yavrusu stereotaksının mikro manipülatörüne sabitleyerek bregma üzerine mümkün olduğunca dikey olarak yerleştirin. Kafatasının yüzeyine dokunmadan elektrodu mümkün olduğunca indirin. Bregmanın koordinatlarını kaydedin (Şekil 6, Panel A).
- Anterior-posterior ve medial-lateral koordinatların yanı sıra bregma ile ilgili olarak ilgilenilen yapının derinliğini belirleyin. Bir tür ve yaşa uygun stereotaksik atlas kullanarak stereotaksik koordinatları belirleyin. Bu durumda, domuz yavruları için özel olarak geliştirilmiş bir stereotaksik atlas kullanın.
- Elektrodu, hem mikroelektrotun hem de aparatın yüzeye dik olduğundan emin olarak uygun ön-arka ve medial-lateral konuma sahip olacak şekilde yeniden konumlandırın. Sahte referans elektrodu, hayvanla teması sağlayacak şekilde kafa derisinin altına yerleştirin (Şekil 6, Panel B).
- Yavaşça ve nazikçe, stereotaksik kolu kullanarak elektrodu beynin içine uygun derinliğe indirin. Son 2 mm için, elektrodu tam konumuna daha fazla sürmek için bir hidrolik mikro sürücü kullanın (Şekil 6, Panel C).
not: Elektrot pozisyonu kraniyotomi penceresinin üzerine örtülmelidir. Elektrot derinliği, ilgilenilen beyin yapısına bağlı olarak değişecektir. Hayatta kalamayan deneylerde veri toplamanın tamamlanmasının ardından insizyonun kapatılmasına gerek yoktur.
4. Sevofluran Anestezisi Altında Hücre Dışı Glutamat Ölçümü
- Domuz yavrusunun bu prosedürün tamamı boyunca sürekli fizyolojik izleme altında olduğundan emin olun. Domuz yavruları, işleme hazırlık olarak inhalasyon yoluyla (yüz konisi yoluyla) uyuşturulur.
- MEA'nın implantasyonundan sonra, 3 saat boyunca doğru ölçümün elde edilmesini sağlamak için elektrotun taban çizgisine ulaşmasına izin vermek için 30 dakika bekleyin (Şekil 7).
- % 0.25 bupivakain (1 mL / kg), postoperatif ağrı yönetimi için ameliyat bölgesinde deri altına uygulanır. Ek olarak, sürekli salınan buprenorfin gerektiğinde deri altına q72h verilir.
