Penetran Mikroelektrot Dizisi Kullanılarak Katlanmamış Hipokampal Dokunun Nöral Aktivitesinin Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Zhang, M., et al. Penetran Mikro Elektrot Dizisi ile Katlanmamış Bir Hipokampal Preparatta Nöral Aktivite Yayılımı. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, katlanmamış bir hipokampustan nöral sinyalleri yakalamak için nüfuz eden bir mikroelektrot dizisi (PMEA) ile bir kayıt odası kurma prosedürünü gösterir. Bu yöntem, in vitro olarak katlanmamış hipokampus içindeki nöral aktivitenin yayılma hızını ve yönünü incelememizi sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik incelemesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Cerrahi ve Deneysel Kayıt için Çözümler

1. (mM) NaCl (sodyum klorür) 124, KCl (potasyum klorür) 3.75, KH₂PO₄ (potasyum dihidrojen fosfat) 1.25, MgS04 (magnezyum sülfat) 2, NaHCO₃ (sodyum bikarbonat) 26, Dekstroz 10 ve CaCl₂ (kalsiyum klorür) 2 içeren normal bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tamponu hazırlayın. Bu normal aCSF'yi diseksiyon sonrası doku geri kazanımı ve deneyin başında yıkama sistemi için kullanın.
2. Hipokampus diseksiyonu sırasında kullanılan ve (mM) içeren sükroz aCSF'yi hazırlayın: Sükroz 220, KCl 2.95, NaH₂PO₄ (sodyum dihidrojen fosfat) 1.3, MgS04 2, NaHCO₃ 26, Dekstroz 10 ve CaCl₂ 2. Sağlam hipokampal doku preparatında epileptiform aktiviteyi indüklemek için, 100 μM konsantrasyonda normal aCSF'ye 4-Aminopiridin (4-AP) ekleyin.

2. Nöral Aktiviteyi Kaydetmek için Katlanmamış Hipokampusu Penetran Mikroelektrot Dizisine (PMEA) Yerleştirme

1. Deney düzeneğini hazırlamak için bir şişeyi normal aCSF ile ve diğer şişeyi 4-AP aCSF ile doldurun. Her iki şişede de, her deneyin en başından itibaren% 95 O₂ /% 5 CO₂ kabarcık dökün. Bir deney sırasında hangi çözümün seçileceğini kontrol etmek için üç valfli bir konektör kullanın. Çözeltiyi bir toz haznesine pompalamak için haznenin çıkışına bir vakum tüpü bağlayın. Boru hattını kayıt odasına teslim etmeden önce ısıtın ve çözeltiyi kontrollü bir sıcaklık seviyesinde (35 °C) tutun.
2. Kayıt odasının girişi ve çıkışı kapatıldığında, katlanmamış hipokampusu odaya aktarmak ve yerleştirmek için özel yapım bir cam pipet damlalığı kullanın. Mikroskop altında, doku çözelti içinde yüzerken normal küçük bir boya fırçası kullanarak katlanmamış hipokampusu konumlandırın. Katlanmamış hipokampusu, alveus tarafı aşağı bakacak şekilde, CA3 alanı uzağa bakacak ve CA1 alanı araştırmacıya bakacak şekilde yerleştirin.
3. Hazne kuruyana ve doku diziye indirilene kadar solüsyon seviyesini düşürmek için kayıt odasının kenarından bir vakum pipeti kullanarak haznedeki solüsyonu dikkatlice emdirin. Ardından, katlanmamış hipokampusu dizi üzerinde tutmak için dokunun üzerine özel yapım bir doku ankrajı (Şekil 1) (Özel Malzemeler ve Ekipmanlarda No. 7) dikkatlice yerleştirin. Yeniden doldurmak için kayıt odasına birkaç damla çözelti koyun ve IV damlama odasında akış hızını saniyede yaklaşık iki damlaya ayarlamak için girişi ve çıkışı kademeli olarak açın.
4. Kurtarmak için kayıt odasındaki dokuyu normal aCSF ile yaklaşık 1 dakika inkübe edin, ardından çözelti beslemesini 4-AP çözünmüş aCSF'ye geçirin ve akış hızını uygun şekilde ayarlayın. Dokuyu 4-AP çözünmüş aCSF'de yaklaşık 5 ila 10 dakika inkübe edin ve daha sonra araştırmacı, spontan aktivite ortaya çıktığında sinyali kaydetmek için yazılımı başlatabilir.

Sonuçlar

Şekil 1. Deney düzeneği. (A) Devreleri olası su hasarına karşı korumak için devrelerin üzerine vidalı plastik bir kapak yerleştirilmiştir. Kayıt odası, çözelti akışını taşımak için hem giriş hem de çıkış borularına sahiptir. Deneyler sırasında dokuyu sabitlemek için Naylon elyaf ağ ile yapıştırılmış özel yapım bir doku ankrajı kullanılır. (B) PMEA'nın cam alt tabakasının altından çek...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
küçük boya fırçası	Lowe'un Evi	tem #: 105657 Model #: 90219	Normal bir boya fırçası paketindeki en küçük boyuta sahip olanı
Yangın cilalı cam yardım aracı	Yok	Yok	Bu alet ateşle parlatıldı ve normal Pasteur cam pipetlerinden yapıldı.
Özel yapım cam iğne	Yok	Yok	Bu alet ateşle parlatıldı ve normal Pasteur cam pipetlerinden yapıldı.
Metal tel halkalı özel yapım cam alet	Yok	Yok	Bu alet ateşle parlatıldı ve yeniden şekillendirilmiş metal tel halkalı normal Pasteur cam pipetlerinden yapıldı.
Özel yapım cam çözeltisi damlalığı	Yok	Yok	Bu alet, uçları kesilmiş ve kesilen uca bağlı bir lastik kafa ile normal Pasteur cam pipetlerinden yapılmıştır.
Özel yapım doku ankraj	Yok	Yok	Naylon elyaf ağ, yalıtılmış bir bakır tel halka üzerine yapıştırıldı. Doku ankrajı bir mikromanipülatör tarafından tutuldu.
Özel fabrikasyon mikroelektrot dizisi	Yok	Yok	Dizi hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen Kibler, et al, 2011'e bakın.
Dizi için özel yapım filtre ve amplifikatör devreleri	Yok	Yok	Dizi hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen Kibler, et al, 2011'e bakın.
Veri toplama işlemcisi 3400a	Mikrostar Laboratuvarları	Yok	Bu, A/D dönüştürücülü eksiksiz bir veri toplama sistemidir.