Bir Elektrofizyoloji Kurulumu Kullanarak Görsel Yol Bütünlüğünü Değerlendirmek için Bir Sıçan Modeli Hazırlama

Özet

Kaynak: Nguyen, C. T. ve diğerleri, Anestezi Uygulanmış Sıçanlarda Elektroretinografi ve Görsel Uyarılmış Potansiyellerin Eşzamanlı Kaydı.J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, retina sağlığını ve görsel yol bütünlüğünü incelemek için bir sıçan modelinin hazırlanışını göstermektedir. Görsel uyarılmış potansiyel ve elektroretinografi referansı ve aktif elektrotlar sıçana bağlanır, ardından eşit retinal aydınlatma için platformu Ganzfeld çanağının önünde sıçan ile hizalar ve dış paraziti önlemek için Faraday kafesi kapatılır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kronik görsel uyarılmış potansiyel (VEP) Elektrotların ön implantasyonu

NOT: Eşzamanlı elektroretinogram (ERG) ve VEP sinyalleri toplanacaksa, sinyal toplamadan en az 1 hafta önce hayvanlara cerrahi olarak VEP elektrotları implante edilmelidir.

1. Deneyden önce cerrahi tezgahı klorheksidin (%70 etanol içinde %0,5) ile temizleyerek sterilize edin. Kullanmadan önce tüm cerrahi ekipmanları otoklavlayın. Hayvanı sterilize edilmiş bir cerrahi örtü ile örtün. Tüm deneycilerin cerrahi maskeler, önlükler ve sterilize edilmiş eldivenler giydiğinden emin olun.
2. 3 L / dk akış hızında O₂ ile% 3 - 3.5 izofluran ile anesteziyi indükleyin. Ameliyat boyunca anesteziyi% 1.5 ve 2 L / dk'da tutun. Pençe sıkıştırma refleksinin olmaması nedeniyle yeterli anestezi derinliğini sağlayın.
3. Gözlerin kurumasını önlemek için kornea üzerine% 1 karboksimetilselüloz sodyum uygulayın.
4. Alnın üzerinde, gözlerin arkasında ve kulakların önünde 30 mm x 30 mm'lik bir alanı tıraş edin.
5. Vücut ısısını korumak ve hayvanın kafasını stereotaksik bir çerçeve ile stabilize etmek için hayvanı bir ısı yastığına (37 ° C) yerleştirin.
6. Traş edilen alanı üç kez% 10 povidon-iyot ile dezenfekte edin. Göze yakın alan için, Cerrahi Teknologlar Derneği tarafından belirlenen Uygulama Standardına uygun olarak alkol bazlı antiseptiklerin kullanımından kaçının.
7. Bir neşter ile kafaya medyan-sagital bir insizyon yapın ve bu eksizyondan kraniyal kemiği ortaya çıkarmak için ~ 20 mm çapında bir dermal doku çemberi yapın.
8. Koronal ve sagital kraniyal sütürleri ortaya çıkarmak için kazıyarak ve gazlı bezle kurulayarak alttaki periosteuumu çıkarın.
9. Bir matkaba bağlı bir diş çapağı kullanarak, stereotaksik koordinatlarda her iki yarım kürede kafatasından iki delik (0,7 mm çap, derinlik ~ 1 mm) açın: 7 mm kaudal ila bregma, 3 mm lateral orta hat.
10. Paslanmaz çelik vidaları (çap 0,7 mm, uzunluk 3 mm, klorheksidin ile sterilize edilmiş) ~ 1 mm derinliğe kadar (2 mm vida açıkta) önceden yapılmış iki deliğe vidalayın, böylece sağlam bir ankraj sağlayın. Bu, alttaki kortikal dokuya zarar vermeden dura ile temas eder.
11. Kraniyal kemiği gazlı bezle kurutarak ve gevşek cildi ~ 4 ve 8 pozisyonlarında iki adet 3 - 0 dikişle geri çekerek cerrahi alanı dental amalgam için hazırlayın.
12. Vida elektrotlarını (adım 1.10'da açıklanan paslanmaz çelik vidalar) yerine sabitlemek için dental amalgamı açıkta kalan kafanın üzerine yayın. Kayıt için vidaların ~ 1.5 mm'sinin açıkta kaldığından emin olun.
13. Retraksiyon dikişlerini çıkarın.
14. Analjezi için% 0.5 karprofen (5 mg / kg) ve sıvı replasmanı için deri altına salin (sodyum klorür% 0.9, 1.5 ml) enjekte edin.
15. Hayvanların ayrı kafeslerde iyileşmesine izin verin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bir hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
16. Ameliyattan tamamen iyileşene kadar (en az 5 gün) hayvanı diğer hayvanların yanına iade etmeyin.
17. 4 gün boyunca günde bir kez analjezi (5 mg / kg) için deri altında% 0.5 carprofen uygulamaya devam edin.
18. Ameliyattan 1 hafta sonra ERG ve VEP'i kaydedin.

2. ERG ve VEP Kaydı

1. Veri toplama hazırlığı
   1. Uyaranı aynı anda tetiklemek ve aşağıda önerilen ayarlara göre veri elde etmek için bilgisayar yazılımını kullanın.
      1. Sinyalleri (ERG: ×1,000, VEP: x10,000) izole edilmiş bir ön amplifikatör ve amplifikatör tarafından dahili olarak ayarlanan kazançla ve her iki göz empedans için eşleşmiş olarak yükseltin.
      2. ERG için örnekleme hızını 650 msn kayıt penceresi (2.560 nokta) üzerinden 4 kHz olarak ayarlayın, Bunu yapmak için, veri toplama yazılımındaki "zaman tabanı" sekmesine tıklayın (yazılımın adı ve sürümü için Malzeme Tablosuna bakın), Örnekler için "2.560" ve 650 ms'lik bir kayıt penceresi döndürecek olan zaman için "500 ms"yi seçin.
         1. VEP'nin örnekleme hızını 250 msn'lik bir dönem boyunca 10 kHz'e ayarlamak için aynı yöntemi kullanın. Hem ERG hem de VEP kayıtları için 10 msn'lik bir ön uyaran taban çizgisine izin verin. Bunu yapmak için, "Kurulum" sekmesine tıklayın; yeni bir diyalog penceresi açmak için "Stimülatörü" seçin; bu pencerede "Mod" için açılır listeden "nabız"ı seçin; ve "gecikme" değerini "10 ms" olarak ayarlayın.
      3. ERG bant geçiren filtrelemeyi 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB) olarak ayarlayın. Bu, veri toplama yazılımında "Bio Amplifier" tıklanarak yapılır. Ardından "Yüksek Geçiş" değerini "0,3 Hz" ve "düşük geçiş" değerini "1 kHz" olarak ayarlayın.
      4. 2.1.1.3'te yukarıda belirtilen yöntemi kullanarak, VEP bant geçirme ayarlarını insan VEP kayıtları için Uluslararası Görme Klinik Elektrofizyolojisi Derneği (ISCEV) tarafından önerildiği gibi 0.1 - 100 Hz (- 3 dB) olarak ayarlayın.

2. Elektrot hazırlama

1. Bir elektrot kablosuna sırasıyla gümüş tel veya bir timsah klipsi takarak ERG aktif/inaktif ve VEP aktif/inaktif elektrotları özel olarak yapın. Ticari olarak toprak elektrodu elde edin.
2. 4 adet özel yapım elektrot için, erkek ucu elektrot ucu uzantısından kesin. İç telin hasar görmemesini sağlamak için dış politetrafloroetilen yalıtım kaplamasını bir neşter bıçağıyla 1 cm çıkarın.
3. 70 mm uzunluğunda bir gümüş tel (0,3 mm kalınlık) keserek ve sıçan gözünü çevrelemek için ~ 8 mm çapında bir halka oluşturarak ERG aktif olmayan elektrotları önceden şekillendirin. 1 ml'lik bir pipet ucunda ilmeği şekillendirerek düzgün bir daire hazırlayın.
4. Sıçan kesici dişlerine asmak için 70 mm uzunluğunda gümüş keserek ve uzunlamasına ~ 8 mm çapında bir elips oluşturarak VEP aktif olmayan elektrotları önceden şekillendirin.
5. 30 mm uzunluğunda bir gümüş tel keserek ve sıçan korneasına (~ 1-2 mm çapında) nazikçe temas etmek için küçük bir halka oluşturarak ERG aktif elektrotlarını önceden şekillendirin
6. Elektrotları (2 ERG aktif, 2 ERG aktif değil, 1 VEP aktif değil), gümüşü açıkta kalan iç tel ile dolaştırarak elektrot kablosuna güvenli bir şekilde takın.
7. Fotovoltaik artefaktları azaltmak için fazla açıkta kalan metali maskeleme bandı ile yalıtın.
8. ERG aktif olmayan elektrotlarda, kemirgen boyun askısına sabit bir şekilde takılmasını sağlamak için maskeleme bandına küçük bir parça cırt cırtlı tutturucu (~ 5 mm × 20 mm) yapıştırın.
9. VEP aktif elektrotlarını yapmak için timsah klipsini elektrot uçlarının iç teline takın.
10. Kayıtlardan önce, sinyal iletimini iyileştirmek için gümüş tellerin açıkta kalan yüzeylerini (yani aktif olmayan halka ve aktif uç) 9 saniye boyunca 20 V DC kaynak kullanarak klorür ile elektrolizle kaplayın.
    1. Bunu yapmak için, ERG elektrot telinin gümüş ucunu (birincil hücrenin anodu olarak işlev görür) normal salin içine daldırın; ve bu elektrot telinin diğer ucunu 9 V pilin pozitif terminaline bağlayın.
    2. Pilin negatif terminaline başka bir kablo (katot) bağlayın ve diğer ucunu da tuzlu suya batırın. 20 saniye sonra bağlantıyı kesin ve ERG elektrot telinin gümüş ucunun beyaz renkte eşit şekilde kaplanmasını gözlemleyin.
       NOT: Klorür kaplamanın açıklığını sağlamak için her deney oturumu için (~ 8 saate kadar) yeni ERG elektrotları hazırlayın.

3. Hayvan hazırlama

1. Işık geçirmez bir odada kayıtlardan önce hayvanları gece boyunca (≥ 8 saat) karanlığa adapte edin. Oda ışıklarını kapatarak ve tüm kapıları ve panjurları kapatarak maksimum karanlık adaptasyonu sağlayın. Kapıların/pencerelerin birleşim yerlerinin etrafına ışık geçirmez malzemeler yerleştirerek ve bilgisayar ekranlarını kalın siyah perdelerin dışına yerleştirerek ışık sızıntısını en aza indirin.
2. Çubuk hassasiyetini sürdürmek için loş kırmızı ışık yayan diyot (LED; 17.4 cd.m-2, λ_max = 600 nm) yardımıyla karanlık bir odada hayvan hazırlığı yapın.
3. Kas içine ketamin / ksilazin (60: 5 mg / kg) enjekte ederek sıçanı uyuşturun. Bir pençe tutam refleksinin yokluğuyla yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
4. Sedasyonu sürdürmek için, gerekirse 50 dakika sonra başka bir anestezi dozu (başlangıç dozunun% 50'si) uygulayın.
5. Ek topikal anestezi için, her göze bir damla% 0.5 proxymetakain uygulayın ve fazla sıvıyı göz kırpın.
6. Göz bebeği genişlemesi için her göze bir damla %0,5 tropikamid uygulayın, ardından fazla sıvıyı kurulayın.

4. ERG ve VEP elektrot konumlandırma

1. Hayvanı, Faraday kafesinde bulunan Ganzfeld kasesinin önündeki ERG platformuna yerleştirin. Elektrofizyolojik kayıtlara elektriksel gürültü girebileceğinden elektrikli ısıtma yastığı kullanmaktan kaçının.
   NOT: Platform, vücut ısısını korumak için sirküle edilmiş bir ısıtılmış su platformuna bağlıdır.
2. Hayvanı, ense etrafına sıkıca yerleştirilmiş ancak sıkıca olmayan bir cırt cırtlı tutturucu şeridi ile platforma sabitleyin.
3. Aktif olmayan VEP elektrodunu anestezi uygulanmış farenin alt kesici dişlerinin etrafına asın.
4. ERG inaktif elektrotlarını, skleral halkayı gözün ekvatorunun etrafına non-invaziv bir şekilde sararak konumlandırın. Ense etrafındaki cırt cırtlı tutturma şeridine elektrotlar takarak bunu stabilize edin. Kontralateral göz için tekrarlayın.
5. Timsah klipslerini kafatasına önceden implante edilmiş paslanmaz çelik vidalara takarak VEP aktif elektrotlarını sabitleyin.
6. Sinyal kalitesini artırmak için ERG aktif elektrodunu yerleştirmeden önce kornea üzerine küçük bir %1 karboksimetilselüloz sodyum damlası damlatın.
   NOT: Viskoz sıvısı, kemirgenlerde kuruma tipi katarakt oluşumunu en aza indirmek için deney boyunca kornea hidrasyonunun korunmasına da yardımcı olur.
7. VEP inaktif elektrodunun temasını ve dolayısıyla sinyal kalitesini iyileştirmek için alt kesici dişlere küçük bir %1 karboksimetilselüloz sodyum damlatın.
8. ERG aktif elektrotlarını, özel yapım bir stereotaksik kola bağlı bir mikromanipülatör kullanarak merkezi kornea yüzeyine hafifçe dokunacak şekilde konumlandırın.
9. Topraklama iğnesi elektrodunun (paslanmaz çelik) 2 - 5 mm'sini deri altından kuyruğa yerleştirin.
10. Gerekirse, sinyal kalitesini artırmak için kayıttan önce alt göz kapağındaki fazla sıvıyı kurutun.
11. Her iki retinanın da eşit şekilde aydınlatılmasını sağlamak için hayvanın gözlerinin kasenin açıklığıyla aynı hizada olduğundan emin olarak platformu Ganzfeld çanağına yaklaştırın (bkz. adım 2.4.1).
12. Yabancı gürültüyü azaltmak için Faraday kafesini kapatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Timsah klipsi	Jenerik marka	HM3022	VEP vidalı elektrotları kablolara bağlamak için paslanmaz çelik 26 mm klips
Biyoamplifikatör	Ekipmanlar	ML 135	ERG ve VEP sinyallerini yükseltmek için
Karboksimetilselüloz sodyum %1.0	Alerji	CAS 0009000-11-7	Aktif ERG elektrodunun sinyal kalitesini artırmak için viskoz sıvı
Carprofen %0.5	Pfizer Hayvan Sağlığı Grubu	CAS 53716-49-7	Tescilli adı: Rimadyl enjekte edilebilir (50 mg / mL). Ameliyat sonrası analjezi için, normal salin içinde% 0.5'e (5 mg / mL) seyreltilmiş
Klorheksadin %0,5	Orion Laboratuvarları	27411, 80085	Cerrahi aletleri dezenfekte etmek için
Sirkülasyonlu su banyosu	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Ameliyat ve elektrofizyolojik kayıtlar sırasında anestezi uygulanan hayvanın vücut ısısını korumak için
Diş amalgamı	DeguDent GmbH	64020024	Elektrot-kafatası düzeneğini daha sağlam hale getirmek için kaplamak için
Diş çapağı	Storz Enstrümanları, Bausch ve Lomb	#E0824A	VEP vidalarını implante etmek için her yarım küre üzerinde kafatasında küçük bir delik açmak için ~ 0,7 mm çapında minyatür bir matkap kafası
alıştırma	Bosch	Dremel 300 serisi	Trepanning için otomatik bir matkap
Elektrot ucu	Çim Telefaktörü	F-E2-30	Gümüş tel elektrotları amplifikatöre bağlamak için platin kablolar
Faraday Kafesi	ısmarlama		Karanlığa adaptasyonu sürdürmek için ışığa dayanıklılık sağlar. Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için Ganzfeld kurulumunu kapsar
Gazlı bez çubukları	Multigate Tıbbi Ürünler Ticaret A.Ş.	57-100B	Ameliyat sırasında cerrahi insizyonu ve açıkta kalan kafatası yüzeyini kurutmak için
Ganzfeld entegre küre	Fotometrik Çözümler Uluslararası		Özel tasarlanmış ışık stimülatörü: 36 mm çap, 13 cm açıklık boyutu
VELCRO	VELCRO Avustralya Ticaret A.Ş.	VELCRO Marka Yeniden Kullanılabilir Wrap	Elektrotları ve hayvanı kayıt platformuna sabitlemek için cırt cırtlı tutturucu
İzofluran% 99.9	Abbott Avustralasya Ticaret Ltd. Şti	CAS 26675-46-7	Tescilli Adı: Isoflo (TM) İnhalasyon anestezisi. VEP elektrot implant cerrahisi için oksijen gazı ile karıştırılmış farmasötik dereceli inhalasyon anestezisi
Ketamin	Troya Laboratuvarları	Ilium Ketamil	Tescilli adı: Ketamil Enjeksiyonu, Marka: Ilium. Elektrofizyolojik kayıt için farmasötik dereceli anestezik
Lüks LED'ler	Phillips Aydınlatma A.Ş.		Işık stimülasyonu için yirmi 5 watt ve bir adet 1 watt LED.
Mikromanipülatör	Harvard Aygıtı	BS4 50-2625	Kayıtlar sırasında ERG aktif elektrodunu tutar
İğne elektrodu	Çim Telefaktörü	F-E2-30	Hem ERG hem de VEP için toprak elektrodu görevi görmek üzere kuyruğa deri altından yerleştirilir
Fenilefrin% 2.5 minim	Bausch ve Lomb	CAS 61-76-7	ERG kaydı için maksimum dilatasyon elde etmek için Tropicamid ile aşılanmıştır
Povidon iyot %10	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Tescilli adı: Betadine, Traş edilmiş cildi ameliyata hazırlamak için antiseptik %10, 500 mL
Powerlab veri toplama sistemi	Ekipmanlar	ML 785	LED'leri kontrol eder
Proxymetakain% 0.5	Alcon Laboratuvarları	CAS 5875-06-9	ERG kayıtları sırasında kornea anestezisi için
Tuzlu su çözeltisi	Jelfleks		Enjekte edilemez, gümüş tel elektrotları galvanik hale getirmek için
Kapsam Yazılımı	Ekipmanlar	Sürüm 3.7.6	Powerlab sistemi aracılığıyla uyarıyı eş zamanlı olarak tetikler ve veri toplar
Gümüş (ince yuvarlak tel)	A & E metal	0,3 mm	Aktif ve aktif olmayan ERG elektrotlarını ve aktif olmayan VEP elektrotunu yapmak için kullanılır
Paslanmaz makara vidaları	Mikro Hızlılar		0.7 mm şaft çapı, 3 mm uzunluğunda primer görsel korteks üzerine implante edilecek ve aktif VEP elektrotları olarak görev
Stereotaksik çerçeve	David Kopf ·	Model 900	Paxinos ve Watson'ın 2007 sıçan beyin atlası koordinatlarına göre birincil görsel korteksleri bulmak için küçük bir hayvan stereotaksik aleti
Cerrahi bıçak	Swann-Morton Ltd.	206	VEP elektrotlarını implante etmek için birincil görsel korteksi kaplayan cilt alanını kesmek için
Dikiş	Şangay Pudong Jinhuan Tıbbi Ürünler Co, Ltd		3-0 ipek örgülü sütür emilmez, VEP elektrot implantasyon ameliyatı sırasında cilt retraksiyonu için
Tobramisin göz merhemi% 0.3	Alcon Laboratuvarları	CAS 32986-56-4	Tescilli adı: Tobrex. Ameliyat sonrası cilt yarası etrafına uygulanan profilaktik antibiyotikli merhem
Tropikanamid %0.5	Alcon Laboratuvarları	CAS 1508-75-4	Tescilli adı:% 0.5 Midriasil göz damlası, ERG kaydı için midriyazis elde etmek için aşılanmıştır
Ksilazin	Troya Laboratuvarları	Ilium Ksilazil-100	Elektrofizyolojik kayıt için farmasötik dereceli anestezik
Pipet ucu	Eppendorf Ticaret Ltd. Şti	0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, ısmarlama elektrotlar için
Lethabarb Euthanazia Enjeksiyonu	Virbac (Avustralya) Ticaret A.Ş.	LETHA450	Hızlı ötenazi için 325 mg / mL pentobarbital sodyum
Microsoft Ofis Excel	Microsoft Bilişim Sistemleri	Versiyon 2010	Veri analizi için elektronik tablo yazılımı

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi yapacak