$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Şişirme Pipeti Aparatının Kurulması
NOT: Bu kurulumun beş temel bileşeni vardır: cam pipet, boru, şırınga, mikromanipülatör ve tampon (Hank's) Tablo 1. Bu kurulumda fizyolojik olarak ilgili tuz konsantrasyonlarına sahip herhangi bir tampon kullanılabilir.
- Bir mikropipet çekicisi kullanarak yaklaşık 45 μm çapında açma ucuna sahip olacak şekilde bir borosilikat pipeti çekin ve Tablo 2.
NOT: Deney koşullarında pipet açıklığının çapı için 45 μm'nin uygun bir boyut olduğu bulunmuştur. Açıklık boyutundaki küçük değişiklikler sonuçları önemli ölçüde etkilememelidir. Bu sayıdan daha büyük sapmaların, pipete boru aracılığıyla bağlanan şırınganın yüksekliğini ayarlayarak varis indüksiyonu için yine de işe yaraması gerektiğine dikkat etmek önemlidir, ancak bu, basınç değerinin yeniden kalibre edilmesini gerektirecektir.
- Pipetin çekilmemiş ucunu ince lastik boruya yerleştirin.
not: Sıvı direncini en aza indirmek için boru duvarı ince ve sert olmalı, şırınganın yüksekliğinin pipetten ihmal edilebilir bir dirençle akan sıvının basıncıyla doğru orantılı olmasını sağlamalıdır. Direnci daha da azaltmak için borunun uzunluğu yaklaşık 0,6 m'den uzun olmamalıdır.
- Borunun diğer ucunu, döndürülebilir valfli bir konektör aracılığıyla 10 mL'lik plastik bir şırıngaya bağlayın.
not: Pipetten akan varsayılan basıncın doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için plastik şırınganın sabit, ölçülebilir bir yükseklikte tutulması gerekir. 190 mm'lik bir yükseklik kullanıldı, çünkü bu minimum basınç sağlar, ancak aksonlarda güvenilir bir şekilde varislere neden olur. Basınç, hücrelerin lamel yüzeyinden ayrılmasına neden oluyorsa, diğer yükseklik değerleri de kullanılabilir. Deney boyunca aynı ayarın kullanılması önerilir.
- Pipeti yerinde tutmak için pipeti mikromanipülatörün vidalı üst kısmına yerleştirin. Mikromanipülatör koluna takılı metal, düz tepeli vidayı, pipetin çekilmemiş ucunu kauçuk borunun takıldığı yerin hemen üzerinde tutacak şekilde vidalayın. Pipeti, nöron içeren lamellerin yüzeyi ile 45°'lik bir açıyla açın. NOT: Mikromanipülatör, pipetin kauçuk boruyu daraltmadan tutulabileceği şekilde yapılmalıdır. Mikromanipülatör, pipeti hücrelerin menzili içinde doğru bir şekilde konumlandırmak için x, y ve z yönlerinde hareket etmesine izin vermelidir. Cihazın bir grafiği ve bir fotoğrafı aşağıda verilmiştir (Şekil 1).
- Bir floresan filtresini açın, diyaframı açın ve objektiften gelen bir floresan noktasının görülebildiğinden emin olun. Mikromanipülatörü kullanarak, pipeti, ucu floresan nokta ile aynı hizaya getirecek bir konuma getirin ve pipeti, hücre kültürü kabının yüksekliğinin (35 mm x 10 mm) hemen üzerinde bir konuma indirin. Yerine oturduğunda, iletilen ışığı açın ve floresansı kapatın.
- Cımbız kullanarak, hücre kültürü plakasından oda sıcaklığında yaklaşık 2 mL Hank tamponu içeren hücre kültürü kabına bir lamel (hücreler pipete doğru bakacak şekilde) ekleyin.
- Lameli içeren kültür kabını dürbünün üzerine yerleştirin.
- İnce odak düğmesini ve 20X objektifi kullanarak, hücrelerin yaklaşık dört tam tur üzerinde (yaklaşık 0,4 mm) bir düzleme odaklanın. Pipet ucunu, göz merceklerinden görüldüğü gibi odaklanacak ve düzlemin ortasında, sol tarafında olacak şekilde konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın.
not: Dendritler, kaynaklandıkları hücre gövdesi ile aynı çerçevede olması gereken çıkıntılardır. Aksonal varisleri indüklemek için, hücre gövdesinden medial ve distal aksonlara daha uzun projeksiyonlar takip edilmelidir.
2. Gerilebilir membran sistemi kullanarak pipetin basıncını kalibre etme
- Şişirme pipet aparatını, mikrofabrikasyon silikon membran (500 μm çapında ve 50 μm kalınlığında) içeren bir sistem üzerine yukarıda tarif edilenle tam olarak aynı parametrelerle kurun ve mikroskobu zarın yüzeyine odaklayın.
not: Bu sistem küçük basınç değerlerini ölçmek için tasarlanmıştır ve sistemin bir açıklaması daha önce yayınlanmıştır. Bu ölçümün, tam olarak aynı şişirme ayarı kullanılıyorsa, şişirme deneyleri için yalnızca bir kez yapılması gerekir.
- Mikroskobu mikro nokta dizilerine odaklayın (merkezler arasında ölçüldüğü gibi 4 μm çapında ve 10 μm aralıklı). Stop valfini çevirin ve sıvının pipetten dışarı akmasına izin verin. Konfokal bir mikroskop ile sıvı basıncına tepki olarak zarın sapmasını inceleyin.
- Membranın sapmasıyla ilişkili karşılık gelen basıncı belirlemek için doğrusal bir model kullanın.
not: Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, 190 mm şırınga yüksekliği için w= -3,143 ± 0,69 μm'lik bir sapma elde edildiği bulunsa da, bu, şırınga yüksekliği tek belirleyici olmasa da, fizyolojik ve patolojik aralıkta olan mevcut pipet kurulumundan 0,25 ± 0,06 nN/μm2'lik bir basınç üretti. Pipet açıklığı, pipet ucunun hücrelere göre konumlandırılması (mesafe ve açı) ve hatta borunun esnekliği dahil olmak üzere diğer faktörler de nöronlar üzerindeki tam basınç değerini etkiler.
3. Varisleri İndüklemek için Şişirme
- Pipet yerine oturduğunda, mikroskobu ilgilenilen bir bölgeyi içeren bir düzleme odaklayın. Hücreleri ve süreçleri, görüntüleme alanının sol yarısındaki (kameranın canlı çekimiyle görülen) şişirme alanı içinde, sağ yarısı şişirme alanının dışındayken konumlandırın.
not: Nöronların aksonlarının ve dendritlerinin geniş büyümesi nedeniyle, bir nöronun tüm süreçlerinin aynı şişirme alanı içinde olması olası değildir. Bu aslında bu sistemin bir avantajıdır ve şişirmenin lokal etkisinin incelenmesine izin verir. Varisleri indüklemek için kullanılabilecek iki tür şişirme vardır: uzun süreli şişirme ve nabız şişirme.
- Şişirme
- Uzun süreli şişirme
- Şırıngayı, kültürlenmiş nöronlar içeren lamel üzerinde 190 mm yüksekliğe yerleştirin. Net nöronal morfolojiyi ortaya çıkaran optimize edilmiş bir pozlama süresiyle ilgi alanının hızlandırılmış görüntülemesine başlayın. Taban çizgisi olarak 2 sn aralıklarla (toplam 30 sn) en az 15 kare yakalayın. Aralık, deneye göre ayarlanabilir. Çerçeve 16'da, şırınganın döndürülebilir stop vanasını açın ve sıvının 75 çerçeve (150 s) boyunca akmasına izin verin. Çerçeve 75'te, sıvı akışının durması için valfi kapatın. Video yakalamayı durdur.
NOT: Bu, 5-10 saniye içinde 7-9 DIV nöronlarında aksonal varislere neden olmalıdır, oysa eski nöronların varisleri oluşturması daha uzun sürer.
- Nabız (2 sn süre) şişirme
- Şırıngayı uygun yüksekliğe (190 mm) yerleştirin. Zaman atlamalı görüntülemeye başlayın ve 2 sn aralıklarla en az 15 kare (30 sn) yakalayın. Çerçeve 16'da, şırınganın valfini açın ve sıvının akmasına izin verin, ardından 2 saniye sonra valfi kapatın. Vanayı tekrar açmadan önce 5-20 s bekleyin (test edilecek frekansa bağlı olarak). Sıvı darbeleri oluşturmak için valfi açıp kapatmayı tekrarlayın ve toplam 150-300 s süreyle devam edin. Kurtarma aşamasını yakalamak için 20 dakika boyunca hızlandırılmış görüntülemeye devam edin.
not: Aralık 10 saniyeden uzun olduğunda, darbeler önemli ölçüde daha az varise neden olur. 20 saniyelik bir aralıkta, darbeler tarafından herhangi bir varisite indüklenemez. Güvenilir, tutarlı varis oluşumu elde etmek için şırınga yüksekliğinin yaklaşık 190 mm olması tavsiye edilir. Şırınga yüksekliği ve sıvı basıncı, hücrelerin lamel yüzeyinden ayrılmaya başladığı bir noktaya yükseltilmemelidir.
- Bir günlük kullanımdan önce, kurulumdan yaklaşık 10 mL %70 Etanol akıtarak kurulumu (pipet, hortum ve şırınga) temizleyin. Etanol yıkamanın ardından, sistemi o günkü kullanıma hazırlamak için 10 mL Hank'in tamponunu (veya istenen tamponu) kurulumdan geçirin. Gün boyunca deneyleri bitirdikten sonra, gece boyunca kirleticilerin büyümesini önlemek için kurulumu daha önce tarif edildiği gibi etanol ile temizleyin.
Tablo 1: Hank'in tampon tarifi. Bu tarif, şişirme protokolünde ve canlı hücre görüntüleme sırasında kullanılan tamponu hazırlar.
| Hank'in tamponu (filtre, pH = 7.4, 4 °C'de saklayın |
| 150 milyon | NaCl (Doğal) |
| 4 milyon | Kartal |
| 1,2 milyon | MgCl2 |
| 1 milyon | CaCl2 |
| 10 mg / mL | D-glikoz |
| 20 milyon | HEPES ÜNİVERSİTESİ |
Tablo 2: Pipet çekme parametreleri. Çapı yaklaşık 45 μm olan bir açıklık elde etmek için pipet çektirmesinde ayarlanacak parametreleri sağlar.
adet
| Pipet çekme parametreleri |
| ısı | çekmek | hız | gecikme | basınç | Rampa |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
