$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mesh Elektroniğinin Canlı Fare Beynine Stereotaksik Enjeksiyonu
>NOT: Fareler, 75 mg / kg ketamin ve 1 mg / kg deksdomitor karışımı ile intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi altına alındı. Ameliyata başlamadan önce anestezi derecesi ayak parmağı sıkıştırma yöntemi ile doğrulandı. Vücut ısısı, farenin anestezi altındayken 37 °C'lik homeotermik bir battaniyeye yerleştirilmesiyle korundu. Ameliyat için tüm metal cerrahi aletlerin kullanımdan önce 1 saat otoklavlanması, sterilize eldiven kullanılması, ameliyat boyunca sıcak boncuk sterilizatörü kullanılması, cerrahi alanın etrafında steril bir alanın korunması, plastik aletlerin %70 etanol ile dezenfekte edilmesi ve tüyden arındırılmış kafa derisinin insizyon öncesi iyodofor ile hazırlanması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere uygun steril teknik uygulandı. Hayatta kalma ameliyatları için, ameliyat bittikten sonra, yaranın etrafına antibiyotikli merhem sürüldü ve fare, 37 ° C'lik bir ısıtma yastığı ile donatılmış bir kafese geri gönderildi. Fareler, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmadı. Farelere, ameliyattan sonra 72 saate kadar her 12 saatte bir vücut ağırlığı 0.05 mg / kg dozunda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla buprenorfin analjezi verildi. Ameliyatın ardından fareler diğer hayvanlardan izole edildi. Fareler, 270 mg / kg vücut ağırlığı dozunda intraperitoneal pentobarbital enjeksiyonu veya transkardiyal perfüzyon yoluyla ötenazi yapıldı.
- Fareyi uyuşturun ve stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerine oküler kayganlaştırıcı sürün.
- Kafatası üzerinde istenen koordinatlarda bir kraniyotomi açmak için bir diş matkabı ve stereotaksik çerçeve kullanın. Paslanmaz çelik topraklama vidası veya telinin yerleştirilmesi için enjeksiyon bölgesinden uzağa ikinci bir kraniyotomi açın.
- Diş çimentosu ile kafatasına bir sıkıştırma alt tabakasını sabitleyin. Prosedürün ilerleyen aşamalarında katlama adımının güvenilirliğini artırmak için alt tabakada yaklaşık 1 mm genişliğinde bir boşluk kesin.
not: "L" şeklinde kesilmiş düz esnek bir kablo (FFC) iyi çalışır (Şekil 4A), ancak birçok malzeme 32 kanallı sıfır yerleştirme kuvveti (ZIF) konektörü (0,18 ± 0,05 mm kalınlığında kablolar için tasarlanmıştır) için doğru kalınlıkta oldukları sürece çalışır.
- Pipet tutucuyu, ağ elektroniği içeren iğne ile dik açılı bir uç cl kullanarak stereotaksik çerçeveye monte edin.amp (Şekil 2C ve Şekil 3A).
- Pipet tutucunun yan çıkışını, yaklaşık 5–3 m uzunluğunda bir kılcal boru kullanarak bir şırınga pompasına (Şekil 0.5D) sabitlenmiş 1 mL'lik bir şırıngaya takın.
not: Pipet tutucuya bağlamadan önce kılcal boruda kabarcık olmadığından emin olun. Kabarcıklar, enjeksiyon sırasında akışı kesintiye uğratabilir ve ağ elektroniğinin düzgün, kontrollü bir şekilde iletilmesini engelleyebilir.
- İğnenin ucunu beyinde istenen başlangıç konumuna yerleştirmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın.
not: Burada kullanılan örgü elektronik problar, yaklaşık 2 mm uzunluğa yayılmış kayıt elektrotları ve ağ elektroniğinin başlangıç kenarından yaklaşık 0,5 mm uzakta bulunan ilk elektrot ile tasarlanmıştır (Şekil 1A'da en sol kenar). Bu nedenle, stereotaksik koordinatlar, başlangıç konumu ilgilenilen beyin bölgesinden 0,5 mm daha derin olacak şekilde seçilmelidir. Kayıt elektrotlarının ağ elektroniği içindeki yayılımı ve konumu, maske tasarım süreci sırasında serbestçe seçilebilir ve kayıt elektrotları, stereotaksik yörüngeleri boyunca enjekte edilirken ilgilenilen beyin bölge(ler)ini kapsayacak şekilde seçilmelidir.
- Kamerayı (Şekil 3B), örgü elektronik probunun üst kısmını cam iğne içinde gösterecek şekilde konumlandırın. Bazı yazılımlar, kullanıcının ağ elektroniğinin orijinal konumunu işaretlemek için ekrana bir çizgi çizmesine izin verir.
- Şırınga pompasını düşük bir hıza ayarlayarak ve Başlat'a basarak akışı başlatın. 10 mL/s, 400 μm iç çaplı bir kılcal iğne için tipik bir başlangıç akış hızıdır. Ağ elektronik probu iğne içinde hareket etmiyorsa akış hızını yavaşça artırın.
not: Beyne enjekte edilen sıvı hacmini en aza indirmek önemlidir, çünkü bu, enjeksiyon bölgesini çevreleyen dokuya zarar verebilir. En iyi sonuçlar, enjekte edilen ağ uzunluğunun 1 mm'si başına 25 μL'den daha az enjeksiyon hacimleri ile elde edilir. İdeal değerler bu hacmin yarısından daha azdır; Laboratuvarımızda tipik olarak enjekte edilen 4 mm'lik bir ağ uzunluğu başına 10-50 μL enjekte ediyoruz.
- Ağ elektroniği probu iğne içinde hareket etmeye başladığında, ağ elektroniğinin işaretli orijinal konumunu kılavuz olarak kullanarak, ağ elektronik probunun enjekte edildiği hızda iğneyi geri çekmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın.
not: Görüş alanı (FoV) enjeksiyon yöntemi olarak adlandırılan bu prosedür, ağ elektroniğinin buruşma veya çıkık olmadan hedeflenen bir beyin bölgesine hassas bir şekilde iletilmesini sağlar. Genellikle, ağ elektronik probu iğne içinde hareket etmeye başladığında akış hızı azaltılabilir. Laboratuvarımızda, ağ ve kılcal iğne duvarları arasındaki statik sürtünmenin üstesinden gelmek için genellikle 20-30 mL/s'lik akış hızları gerekir, ancak enjeksiyon işlemi başlatıldıktan sonra hız 10 mL/s'ye düşürülebilir. Akış hızları ve enjeksiyon hacimleri genellikle daha küçük çaplı kılcal iğneler için daha küçüktür.
- İğne kafatasından çıkana kadar tuzlu su akıtmaya ve iğneyi geri çekmeye devam edin. Şırınga pompasından gelen akışı durdurun.
2. Giriş/Çıkış Arayüzü
NOT: Bu noktada, örgü elektronik probu, seçilen yörünge boyunca beyin içinde istenen başlangıç noktasından enjekte edilmiştir. İğne geri çekilmiştir ve beyinden iğneye uzanan ağ elektronik bağlantıları ve hala iğnenin içinde olan giriş/çıkış (I/O) pedleri ile kraniotominin hemen üzerindedir (Şekil 4B). Bu bölümde bir baskılı devre kartı (PCB; Şekil 4, Şekil 5) örgü elektronik probuna arayüz oluşturmak için. PCB, nöral kayıt deneyleri için baş aşama haline gelen yalıtkan bir alt tabaka aracılığıyla bir ZIF konektörünü 32 kanallı standart bir amplifikatör konektörüne bağlar. PCB, çeşitli kafa aşaması konfigürasyonlarına uyum sağlamak için özelleştirilebilir. Tasarım dosyalarımız istek üzerine veya meshelectronics.org kaynak web sitesinden temin edilebilir ve PCB üretim ve montaj hizmetleri satıcılarından ucuza PCB satın almak için kullanılabilir.
- İğneyi FFC sıkıştırma alt tabakasına ve boşluk boyunca dikkatlice yönlendirmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın, ağ elektroniği ara bağlantılarında gevşeklik oluşturmak için çözeltiyi şırınga pompası ile akıtın (Şekil 4C).
- İğne, sıkıştırma alt tabakasının üzerine ve boşluk boyunca olduğunda, ağ elektroniği G/Ç pedlerini sıkıştırma alt tabakasına çıkarmak için akışa hızlı bir şekilde devam edin (Şekil 4D).
- Cımbız ve bir pipet deiyonize su (DI) kullanarak, G/Ç pedlerini ilk G/Ç pedine mümkün olduğunca yakın yaklaşık 90° açıyla bükün.
not: Bükme, pedlerin bir sonraki adımda bir PCB üzerindeki ZIF konektörüne takılmasına izin vermek için gereklidir. ZIF konektörü, örgü elektronik probun 32 G/Ç pediyle tam olarak aynı genişliktedir, bu nedenle kusurlu bir 90° bükülme veya ilk G/Ç pedinden hemen önce meydana gelmeyen bir bükülme, G/Ç pedlerini kesmek zorunda kalmaya neden olur (Şekil 4E'deki en soldaki pedler).
- G/Ç pedleri hizalandıktan sonra, açıldıktan ve ağ gövdesine 90° açıyla yerleştirildikten sonra, hafifçe akan basınçlı hava ile yerlerine kurutun.
not: 32'den az kanala sahip örgü elektronik problar, aynı 32 kanallı arayüz kartı ile arayüzlenebilir. Örneğin, laboratuvarımız genellikle 32 kanallı PCB'lerle 16 kanallı örgü elektronik probları kullanır. Bu, ZIF konektörü içinde ekstra alan sağlayarak arabirim oluşturmayı kolaylaştırır ve ek temassız kanallar, kayıt oturumları sırasında empedans testi yoluyla kolayca açık devre olarak tanımlanır.
- Sıkıştırma alt tabakasını, G/Ç pedlerinin kenarından yaklaşık 0,5–1 mm uzakta düz bir kenardan kesin. Ayrıca, PCB'ye monte 32 kanallı ZIF konektörüne yerleştirmeyi engelleyecek sıkıştırma alt tabakasının yabancı parçalarını da kesin (Şekil 4F).
- G/Ç pedlerini PCB üzerindeki ZIF konektörüne takın ve mandalı kapatın (Şekil 4G). Başarılı arayüzü doğrulamak için kanallar ve topraklama vidası arasındaki empedansı ölçmek için ölçüm elektroniğini kullanın. Empedans değerleri çok yüksekse, ZIF konektörünün mandalını açın, yerleştirmeyi ayarlayın ve başarılı bağlantı onaylanana kadar yeniden test edin.
- ZIF konektörünü ve açıkta kalan ağ elektroniği ara bağlantılarını koruma için diş çimentosu ile kapatın. PCB'yi alt tabakadaki boşlukta çevirin ve PCB'yi çimento ile fare kafatasının üzerine sabitleyin (Şekil 4H).
not: FFC'nin boşlukta bükülmesi, bazen ağ elektroniği ara bağlantılarını kırabilecek mekanik gerilimi azaltır.
- Çimentonun sertleşmesine izin verin, PCB'yi sonraki kayıt oturumları sırasında arayüz oluşturmak için sağlam, kompakt bir kafa aşamasına dönüştürün (Şekil 4I).
3. Sinirsel Kayıt Deneyleri
- Fareyi bir kuyruk tabancasına veya başka bir sınırlayıcıya yerleştirin. Önünü takınampPCB'yi standart amplifikatöre yerleştirin amplifier kafa üzerindeki tage PCB. Referans vidasını topraklamak için ayrı bir kablo kullanın.
- Kısıtlanmış kayıtlar için fareyi sınırlayıcıda bırakın. İstenilen süre boyunca veri toplama sistemini kullanarak verileri kaydedin (Şekil 5A).
- Serbestçe hareket eden kayıtlar için, önamplifier PCB'sini taktıktan ve referans vidasını toprakladıktan sonra fareyi sınırlayıcıdan serbest bırakın. Fare serbestçe davranırken veri toplama sistemini kullanarak istenen süre boyunca kayıt yapın (Şekil 5B)
