Beyin Dilimlerinde Elektrofizyolojik Kayıtlar için Tüm Hücre Voltaj-Kelepçe Konfigürasyonunun Oluşturulması

Özet

Kaynak: Sunstrum, J. K., et al. Tam hücre yama-kelepçe elektrofizyolojisi kullanılarak sinaptik çokluğun değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, ince uçlu bir pipetin beyin dilimlerinin yakınına yerleştirilmesini ve bir nöronal hücre ile bir mühür oluşturmasını göstermektedir. Emme, hücre zarını kırar, böylece elektrofizyoloji deneyleri için akım ölçümlerini sağlayan bir tam hücre yama kelepçesi oluşturur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Çözümler

1. Dilimleme çözeltisi
   1. Dilimleme çözeltisinin bileşimi için Tablo 1'e bakın.
   2. Önceden 20x stok solüsyonu hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
   3. 1x dilimleme çözeltisi için NaHCO3, glikoz ve sakarozu ddH₂O içinde çözün ve 20x stoğu ekleyin. Ozmolaritenin 315 ila 320 mOsm arasında olduğundan emin olun ve çözeltiyi 4 °C'de en fazla 1 hafta saklayın.
   4. İki kabı 100 mL dilimleme solüsyonu ile doldurun ve üzerlerini parafilm ile kaplayın. Çözeltiyi kısmen donana kadar bir dondurucuda soğutun (-80 °C dondurucuda yaklaşık 20 dakika). Bir gaz dispersiyon tüpü kullanarak, her iki dilimleme çözeltisi kabını da %95 O2 /%5 CO2 ile 20 dakika buz üzerinde köpürtün.
2. aCSF (Yapay beyin omurilik sıvısı), dilim geri kazanımı ve bakımı için
   1. aCSF'nin bileşimi için Tablo 1'e bakın.
   2. Önceden 20x stok solüsyonu hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
   3. 1x aCSF için NaHCO3 ve glikozu ddH2O'da çözün ve 20x stoğu ekleyin. Ozmolaritenin 298-300 mOsm arasında olduğundan emin olun. Solüsyonu 1 gün içinde kullanın.
3. aCSF (kayıt için düşük Ca²⁺)
   1. Düşük Ca^{1 +} aCSF'nin bileşimi için Tablo 2'e bakın.
   2. Önceden 20x stok solüsyonu hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
   3. 1x düşük^Ca2+ aCSF için, NaHCO3 ve glikozu ddH2O'da çözün ve belirtilen konsantrasyonlara 20x (CaCl2 ve MgCl2 içermeyen) stok, CaCl2 ve MgCl2 ekleyin. Ozmolaritenin 298-300 arasında olduğundan emin olun. Solüsyonu 1 gün içinde kullanın.
4. aCSF (kayıt için Sr²⁺)
   1. Sr¹⁺ aCSF'nin bileşimi için Tablo 2'e bakın.
   2. Önceden 20x stok solüsyonu hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
   3. 1x Sr^{2 +} aCSF için, NaHCO3 ve glikozu ddH2O'da çözün ve belirtilen konsantrasyonlara 20x (CaCl2 ve MgCl2 içermeyen) stok, SrCl2 ve MgCl2 ekleyin. Ozmolaritenin 298-300 arasında olduğundan emin olun. Solüsyonu 1 gün içinde kullanın.
5. Dahili çözüm
   1. K-glukonat bazlı iç çözeltinin bileşimi için Tablo 1'e bakın.
   2. 20 mL iç çözelti yapmak için, 50 mL'lik bir tüpe 15 mL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin. Ardından, sonraki adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
   3. Moleküler biyoloji sınıfı suda 1 M stok konsantrasyonlarına kadar aşağıdaki çözeltileri önceden hazırlayın. (mL cinsinden): 2.32 K-glukonat, 0.24 Na-glukonat, 0.20 HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit), 0.16 KCl, 0.05 K_2-EGTA (Potasyum etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N ', N ' -tetraasetik asit), 0.04 MgCl2 50 mL tüpe.
   4. 100 μL 0.3 M Na₃GTP (Guanozin 5-trifosfat sodyum tuzu) ekleyin
   5. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 44.08 mg K2 ATP (Adenozin 5 "-trifosfat dipotasyum tuzu) tartın ve 1 mL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin, ardından 50 mL'lik bir tüpe ekleyin.
   6. 1 M KOH ile pH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın. Ozmolaritenin 283-289 mOsm arasında olduğundan emin olun.

2. Dilim Hazırlama

1. Araçları hazırlayın
   1. Geri kazanım odasına 200 mL aCSF ekleyin (4 kuyulu ve ağlı 250 mL'lik bir beherden yapılmıştır) ve geri kazanım odasını bir su banyosuna (35 °C) yerleştirin.
   2. Hazneyi bir parafin film ile örtün ve aCSF'yi en az 20 dakika boyunca bir cam dispersiyon tüpü kullanarak sürekli olarak %95 O2/%5 CO2 ile köpürtün.
   3. Diseksiyon aletlerini ayarlayın (neşter, açılı ince makas, forseps, ince boya fırçası, plastik kaşık).
   4. 60 mL'lik bir şırıngayı, adım 1.1.4'ten itibaren yaklaşık 15 mL buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu ile doldurun.
   5. Filtre kağıdını bir kuyu plakasının kapağına yerleştirerek diseksiyon platformunu hazırlayın.
   6. Dilimleme haznesini buz kalıbına yerleştirerek ve tepsiyi buzla doldurarak hazırlayın.
   7. Bıçak tutucusuna tek kullanımlık bir bıçak sabitleyerek vibratomu ayarlayın.
   8. Bir transfer pipeti yapmak için bir Pasteur pipetinin ucunu kırın ve kırılan ucun üzerine bir lastik ampul yerleştirin.
2. Fare beynini inceleyin
   1. Hayvanı% 4 izofluran ile doyurulmuş bir odada, omurga refleksleri yok olana kadar uyuşturun.
   2. Bir giyotin kullanarak hayvanın kafasını kesin ve beynini hızla çıkarın.
      1. Rostral'dan kaudal doğruya 22 numaralı neşter bıçağı ile orta hat kesisi yapın.
      2. Yanal olarak, başın her iki tarafındaki kafa derisini soyun.
      3. Beyne zarar vermemeye dikkat ederek kafatasını bir taraftan kaudalden rostral'a (ön kemiklerin tarafı dahil) kesmek için ince makas kullanın.
      4. Kafatası parçasını beyinden kaldırmak için forseps kullanın ve adım 2.1.4'teki şırıngayı kullanarak beyni 15 mL buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu ile hızla soğutun.
      5. Beyni kafatasından çıkarın.
      6. Beyni, %95 O2/%5 CO2 ile köpürtülmüş buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu (adım 1.1.4'ten itibaren) ile doldurulmuş beherlerden birine yerleştirin.

3. Fare hipotalamus dilimleri hazırlayın.

1. İstenen beyin alanı ve kesim açısı için beyni bloke edin (örneğin, koronal hipotalamik dilimler için, bir bıçak kullanarak doku rostralını optik kiazmaya ve kaudal ponsa kesin ve kaudal bloğun beynin tabanına dik düz bir yüzeye sahip olduğundan emin olun).
2. Kesilmiş bir filtre kağıdı parçası kullanarak, beyni ön taraftan alın ve arka tarafı anında yapıştırıcı kullanarak tutma plakasına yapıştırın.
3. Tutma plakasını hızlı bir şekilde dilimleme haznesine yerleştirin ve adım 1.1.4'teki ikinci beherden gelen dilimleme solüsyonu ile doldurun.
4. Dilimleme haznesini ve buz tepsisini vibratomun üzerine sabitleyin.
5. Dilimleme alanını (beynin ön ve arkası) tanımlayın ve 250 μm kalınlığında koronal dilimler dilimlemeye başlayın. Önerilen parametreler: hız 0,10 mm/sn, genlik 2 mm.
6. Dilimleri istenen beyin bölgesi için uygun boyuta kesin.
7. Dilimleri 35 °C'de 30-45 dakika geri kazanın. Ardından, toparlanma haznesini ısıtma banyosundan çıkarın ve dilimlerin oda sıcaklığında 30 dakika daha iyileşmesine izin verin. Dilimleri günün geri kalanında oda sıcaklığında tutun ve banyoyu sürekli olarak %95 O2 / %5 CO2 ile köpürtmeye devam edin.

3. Tüm Hücre Yama ClampRecording

1. Yama pipetlerini çekin.​
   1. Pipet çektirme kılavuzundan tüm hücre kaydı için önerilen parametreleri kullanarak, yama pipetlerini kalın duvarlı camdan 3-5 MΩ'luk bir pipet direncine çekin.
   2. Bir mikroşırınga (ticari veya ev yapımı) kullanarak, bir pipet ucunu filtrelenmiş bir iç çözelti ile doldurun. Mikro şırınga yapmak için 1 mL'lik bir şırınganın ucunu yakın ve ucun düşmesine izin vererek uzun, ince bir uç oluşturun.
2. Tüm hücre konfigürasyonunu elde edin.
   1. Kayıt pipetini dilimin hemen üzerine yerleştirin ve pipet akımını voltaj kelepçesi modunda dengeleyin. Pipete hafif pozitif basınç uygulayın ve vanayı kilitleyin.
   2. Sağlam bir zarı olan sağlıklı bir hücre seçin ve pipetle yaklaşın. Pozitif basınç, dokuda hafif bir rahatsızlığa neden olmalıdır (yani, dokuya girerken yavaş bir dalga).
   3. Pipet hücre yüzeyinde küçük bir çukur oluşturana kadar çapraz bir hareketle pipeti hücreye yavaşça yaklaştırmaya devam edin.
   4. Pozitif basınç kilidini serbest bırakın. Hücre bir conta oluşturmaya başlayacak ve direnç 1 GΩ'un üzerine çıkacaktır. Voltaj kelepçesinde, hücreyi -68 mV'de tutun.
   5. Hücredeki fazla basıncı gidermek için hücreden çapraz olarak hafifçe çekin.
   6. Hızlı ve yavaş pipet kapasitansını telafi edin.
   7. Hücreyi kırmak ve tam hücre konfigürasyonu elde etmek için pipet tutucuya bağlı tüpten kısa bir emme uygulayın.
   8. Bir elektrofizyoloji Veri toplama ve analiz yazılımında (örneğin, Clampex) membran test penceresinde Hücre moduna geçin.
   9. Her voltaj kelepçesi kaydından önce, aynı yazılımı kullanarak bir membran testi yapın ve ilgili parametreleri bir laboratuvar kitabına kaydedin (membran direnci, erişim direnci ve kapasitans).
   10. Sonraki deneyler için kayıt banyosunun sıcaklığını 27–30 °C'de ve akış hızını 1.5–2.0 mL/dk'da tutun.

Tablo 1: Çeşitli çözeltilerin bileşimi.

	çözelti konsantrasyonları (mM)
	Dilimleme	Normal aCSF	Düşük Ca2+ aCSF	Sr+ aCSF	Pipet/Dahili
NaCl (Doğal)	87	126	126	126	-
Kartal	2,5	2,5	2,5	2,5	8
CaCl2	0,5	2,5	0,5	-	-
SrCl2	-	-	-	2,5	-
MgCl2	7	1.5	2,5	1.5	2
NaH2PO4	1,25	1,25	1,25	1,25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
glikoz	25	10	10	10	-
Sakaroz	75	-	-	-	-
K-glukonat	-	-	-	-	116
Na-glukonat	-	-	-	-	12
HEPES ÜNİVERSİTESİ	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0,3

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 ml şırınga	Bd	309659
10 bıçak	Fisher Scientific/diğerleri	35698
22 bıçak	VWR/diğerleri	21909-626
22 uM şırınga filtreleri	Milipore	09-719-000
Adson ön pazı	Harvard Enstrümanları	72-8547
Açılı keskin makas	Harvard Enstrümanları	72-8437
Kelepçe	Moleküler Cihazlar	pKelepçe 10
Çift kenarlı bıçak	VWR (VWR)	74-0002
Filtre kağıdı	Sigma/diğerleri	1001090
İnce boya fırçası	Balıkçı/çeşitli	15-183-35/Çeşitli
Gaz Dispersiyon Tüpü	VWR (VWR)	LG-8680-120
İzofluran	Fresenius Kabi/diğerleri	M60303
Krazy tutkal	çeşitli	çeşitli
Mini analiz	Özet Yumuşak	Mini Analiz 6
Osmomoter (Ozmomotif)	Wescor Inc	Ürün Kodu: 5600
Parafilm Filmi	Sigma	PM-996
Pasteur pipeti	VWR (VWR)	14672-200
pH Metre	Mettler Toledo	FE20-ATC
Kauçuk ampul	VWR (VWR)	82024-550
Neşter sapı No. 3	Harvard Enstrümanları	72-8350
Neşter sapı No. 4	Harvard Enstrümanları	72-8356
Tek kenarlı bıçak	VWR (VWR)	55411-050
Vibratom dilimleyici	Leica Belediyesi	VT1200S
Su Arıtma Sistemi	Kırlangıç	Milli-Q Akademik A10
Kuyu plakası kapağı	Balıkçı/çeşitli	07-201-590/çeşitli
CaCl2 2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	Sigma	202908
EGTA (EGTA)	Sigma	E3889
glikoz	Sigma	G5767
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
Kartal	Sigma	P9333 Serisi
K-glukonat	Sigma	G4500
MgCl2 6H2O	Sigma	M2670
Moleküler biyoloji sınıfı su	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl (Doğal)	Biyodükkan	SOD001.1
Na-glukonat	Sigma	S2054 Serisi
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014 Serisi
Pikrotoksin	Sigma	P1675 Serisi
SrCl	Sigma	255521
Sakaroz	Biyodükkan	SUC507.1

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi