Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. pHuC_Mermaid Plazmid Üretimi
>NOT: Deniz Kızı, fosfataz (Ci-VSP) içeren Ciona intestinalis (şimdi Ciona robusta) voltaj sensörünün voltaj algılama alanının (VSD) floresan rezonans enerji transferi (FRET) ortağı floroforlar Umi-Kinoko Green (mUKG: donör) ve portakal yayan floresan proteini Kusabira Orange'ın (mKOk: alıcı) monomerik bir versiyonu ile eşleştirilmesiyle geliştirilen bir biyosensördür. Bu biyosensör için, membran depolarizasyonu ile indüklenen VSD alanındaki konformasyonel değişiklikler, verici ve alıcı floresan proteinlerin yakınlığını arttırır, böylece aralarındaki enerji transferini arttırır (FRET Oranını arttırır). VSD, biyosensörün plazma zarında verimli bir şekilde lokalizasyonunu sağlar. Biyosensörün nöronal ekspresyonu (omurilikte, sinyal hem internöronlarda hem de motor nöronlarda tespit edilebilir), zebra balığı pan-nöral promotörü HuC altında Deniz Kızı açık okuma çerçevesinin (ORF) klonlanmasıyla elde edilir.
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile PCS4+ Deniz Kızı plazmidinden Pfu (düzeltme) DNA polimeraz ile T3 Evrensel primer ve Deniz Kızı SmaI primer (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) kullanarak yükseltin Deniz Kızı ORF'nin yukarı akışında bir Sma Ikısıtlama bölgesi eklemek için.
- Aşağıdaki PCR karışımını kullanın: 0.5 μL Pfu DNA polimeraz, 7.5 μL spesifik 10x tampon, 1 μL 10 mM deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP'ler), 2.5 μL dimetil sülfoksit (DMSO), 0.5 μL (50 ng) plazmit preparatı ve toplam 50 μL hacimde her bir primerin 1 μL 20 μM stok çözeltileri.
- PCR karışımını 95 °C'de 15 saniye ısıtın, 50 °C'de 15 saniye hazırlayın ve toplam 35 döngü için 72 °C'de 4 dakika uzatın.
- Üreticinin protokolünü izleyerek ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak belirli künt PCR ürününü jel ile saflaştırın.
- DNA parçasını, üreticinin protokolünü izleyerek pCMV-SC künt vektörüne klonlayın.
- HuC promotörününün bir sonraki yerleştirilmesi için Deniz Kızı pozitif plazmidini (pCMV-SC_Mermaid olarak adlandırılır) SmaI kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırın.
- Kısıtlama reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 0.5 μL (10 U) SmaI kısıtlama enzimi, 2 μL kit 10x tamponu ve toplam 20 μL hacimde 5 μg plazmit DNA. Reaksiyonu 25 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Sindirilmiş plazmidi, üreticinin protokolünü takip eden ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak jel ile saflaştırın.
- Bir çift HuC'ye özgü primer (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA ve HuCprom-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) kullanarak şablon olarak Pfu DNA polimeraz ve zebra balığı genomik DNA ile HuC promotörünü (pHuC) PCR-amplifiye edin ve ATG'nin yukarı akışında 3.150 bp'lik bir bölgeyi kapsar.
- Aşağıdaki şemayı kullanarak PCR karışımını ayarlayın: 0.5 μL Pfu DNA polimeraz, 7.5 μL spesifik 10x tampon, 1 μL 10 mM dNTP, 2.5 μL DMSO, 200 ng genomik DNA ve 1 μL 20 μM stok çözeltileri toplam 50 μL hacimde her bir primerin stok çözeltileri.
- 95 °C'de 2 dakikalık bir ilk adımdan sonra, PCR karışımını 95 °C'de 15 saniye ısıtın, 50 °C'de 15 saniye bekletin ve toplam 35 döngü için 72 °C'de 4 dakika uzatın.
- Üreticinin protokolünü izleyerek ticari bir jel saflaştırma kiti kullanarak belirli künt PCR ürününü jel ile saflaştırın.
- Toplam 10 μL'lik bir hacimde 1 μL T4 DNA ligaz ve 1 μL spesifik 10X tamponu kullanarak saflaştırılmış pCMV-SC_Mermaid (adım 1.5) ve pHuC DNA'nın (adım 1.7) eşmolar bir miktarını bağlayın. Reaksiyonu 4 ° C'de 16 saat inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek 5 μL ligasyon reaksiyonu (adım 1.8) ile yetkin hücrelerin bir alikotunu dönüştürün.
- Bir Sal I-EcoRV çift sindirimi ile promotör uygun oryantasyonda yerleştirilmiş olarak pHuC pozitif klonları (pHuC_Mermaid) seçin (SalI kısıtlama bölgesi, adım 1.6'da promotör fragmanının yukarı akışına yerleştirilmiştir, Eco RV kısıtlama bölgesi ise pCMV-SC plazmidinin poliadenilasyon bölgesinin, PolyA'nın akış aşağısına yerleştirilmiştir).
- Kısıtlama reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 0.5 μL (10 U) hem SalI hem de EcoRV kısıtlama enzimleri, 2 μL kit10X tamponu ve toplam 20 μL hacimde 1 μg pHuC_Mermaid DNA. Reaksiyonu 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Reaksiyonları bir agaroz jeli üzerine çalıştırın.
2. Embriyo Mikroenjeksiyonu
- Yabani tip (AB suşu) veya Sod1-G93R yetişkin zebra balığından elde edilen döllenmiş yumurtaları plastik bir pipet kullanarak 10 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
- Embriyoları soğuk (4 °C) balık suyunda durulayın ve hemen bir mikroenjektör kullanarak 200 pg pHuC_Mermaid plazmid ile yumurta sarısına mikroenjekte edin (mikroenjeksiyon prosedürünün genel ve ayrıntılı bir açıklaması için).
- Plastik bir pipet kullanarak, embriyoları bir Petri kabına aktarın ve sonraki analizler için istenen gelişim aşamasına (döllenmeden 20-24 saat sonra, hpf) ulaşana kadar 28 ° C'de balık suyunda kuluçkaya yatırın.
3. Kendiliğinden Kuyruk Kıvrılma Analizi
>NOT: İlaç riluzol olsun veya olmasın 20-24 hpf embriyolarında spontan kuyruk sarma davranışını değerlendirin.
- Bir embriyoyu% 0.2 DMSO (riluzole aracı) içeren balık suyu ile doldurulmuş 90 mm'lik yuvarlak bir Petri kabına aktarın ve keskin uçlu iki kuyumcu forseps kullanarak manuel olarak dekoryonlayın. Embriyoyu 5 dakika inkübe edin.
- Stereomikroskop üzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanarak 1 dakikalık bir video kaydı sırasında oda sıcaklığında (RT) kuyruk sargısını tespit edin. 30 kare/sn'lik bir zaman çözünürlüğünde zaman serileri elde edin.
- Zaman birimi başına bükülme sayısını (hem kontralateral hem de ipsilateral) sayarak spontan kuyruk sargılarının sıklığını hesaplayın.
- İlacın riluzole etkisini değerlendirmek için, embriyoyu 5 μM riluzol içeren balık suyu ile doldurulmuş 90 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarmak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın.
- 1 dakikalık bir video kaydetmeden ve yukarıdaki gibi davranış analizini gerçekleştirmeden önce embriyoyu 5 dakika inkübe edin.
4. Canlı Embriyolarda Deniz Kızı Biyosensör Görselleştirmesi için Görüntüleme Kurulumu: Donör ve Alıcı Sinyallerinin Eş Zamanlı Tespiti
- 20 - 24 hpf embriyosunu, 35 mm'lik cam tabanlı bir görüntüleme kabı içinde 37 ° C'de balık suyunda% 1 düşük erime noktalı agaroz içine monte edin. Embriyoları yanlarına yönlendirin. Agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bekleyin.
- Görüntüleme çanağını, ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edilmiş ters konfokal bir aşamaya aktarın. mUKG'yi 488 nm argon lazer çizgisi ile uyararak ve emisyonunu 495 ile 525 nm arasında kaydederek biyosensörü 20X objektifle (0,7 sayısal açıklık, NA) ifade eden motor nöronları tanımlayın.
- FRET ölçümü için, FRET çiftinin donörü olan mUKG'yi 488 nm lazer çizgisi ile uyarın. Çift yönlü modda 8.000 Hz'de çalışan bir rezonans tarayıcı ile donör tarafından yayılan floresanı (495 ila 525 nm arasında) ve mKOk alıcısı tarafından yayılan floresansı (550 ila 650 nm arasında, FRET kanalı) aynı anda tespit edin. Varsa, 473 nm lazeri kullanın.
not: Donörün uyarma verimliliği biraz azalacaktır (488 nm ile %93 yerine %85), ancak alıcının çapraz uyarılması da azalacaktır (488 nm ile %17'den 473 nm lazer çizgisi ile %9'a).
- Fototoksisiteyi ve florofor ağartmayı azaltmak için, lazer çizgisinin gücünü azaltarak (alım yazılımının ışın yolu penceresinde) numunenin aydınlatmasını en aza indirin.
- Uyarımı, deneyin başında ayarlanan ve oturum boyunca sabit tutulan kazanç ve ofset parametreleriyle eşleşecek şekilde optimize edin. Ofseti ayarlamak için, görüntünün rengini yoğunluk değerlerine değiştirin (Q arama tablosunu kullanarak) ve lazer kapalıyken tarama yaparken, arka plan piksellerinin yoğunluğu sıfırdan biraz daha yüksek olacak şekilde ofset düğmesini (akıllı ofset) çevirin. Aynı arama tablosuyla, tarama sırasında lazeri açarak, doygun piksellerden kaçınmaya dikkat ederek sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için kazanç düğmesini (akıllı kazanç) çevirin.
- Açılmış bir iğne deliği (2 havadar birim) kullanarak, nicel analizler için yeterli dinamik aralık sağlamak üzere 16 bitlik görüntüler elde edin. Alım hızını artırmak ve foto ağartmayı en aza indirmek için ortalamayı almaktan kaçının.
- Yazılım edinme penceresinde, açılır menüden 512 x 64 piksel (piksel boyutu: 605 nm) bir görüntü alanı boyutu seçin.
- Edinme modu penceresinden, açılır menüden xyt'yi (tek bir xy düzleminde zaman atlamalı) seçin ve tek bir xy düzlemi elde ederek embriyo spinal nöron voltajındaki değişiklikleri kaydedin, edinim parametrelerini 1 dakika boyunca her 30 ms'de bir görüntü kaydedecek şekilde ayarlayın.
- Riluzol uygulamasının aynı nörondaki membran depolarizasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, 5 μM riluzol içeren balık suyunun eklenmesinden 5 dakika sonra yeni bir veri seti edinin.
- FRET analizi için ImageJ makro Biosensor_FRET kullanın (tek zincirli FRET biyosensörlerini ifade eder.)
- t1'deki her nöronun bazal membran FRET oranını şu şekilde değerlendirin ((FRET ortalaması - FRET arka planı)/(Donör ortalaması - Donör arka planı)), burada FRET ve Donör ortalama yoğunluğu, elde edilen her kanal için hücre etrafında çizilen aynı ilgi bölgesinde (ROI) hesaplanan ortalama floresan yoğunluğudur ve FRET ve Donör arka planı, floresan numunesi olmadan görüş alanının bir ROI'sinde hesaplanan ortalama floresan yoğunluğudur.
not: Eklentinin kullanımına ilişkin ayrıntılı bir adım adım açıklama www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret web sitesinde bulunabilir.
- Farklı deneysel paradigmalar arasındaki depolarizasyonun sıklığını, genliğini ve süresini karşılaştırmak için bir grafik yazılımı kullanın. Eşleştirilmemiş bir Öğrenci t-testi kullanarak iki grubu karşılaştırın ve P <0.05 olduğunda ortalama değerleri istatistiksel olarak farklı olarak kabul edin.
