Drosophila Retinal Fotoreseptörlerinin Işık Uyaranlarına Voltaj Yanıtlarının Elektrofizyolojik Kaydı

Özet

Kaynak: Juusola, M., et al. Drosophila Fotoreseptörlerinin ve İnternöronlarının Işık Uyaranlarına Hücre İçi Voltaj Tepkilerinin Kaydedilmesi için Elektrofizyolojik Yöntem In Vivo. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, hareketsiz hale getirilmiş bir Drosophila'nın gözündeki fotoreseptör aktivitesinin elektrofizyolojik kaydı için protokolü ana hatlarıyla belirtir ve ışık uyaranlarına yanıt olarak voltaj değişikliklerinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Protokol

1. R1-R6 Fotoreseptörlerinden Kayıt

1. Mikroelektrot amplifikatörünü çalıştırırken daima topraklayın (örn.ampFaraday kafesinin veya titreşim önleyici masanın metal yüzeyine dokunarak), çünkü bu, birinin yanlışlıkla kafa aşamasına statik bir yük iletmesini engeller, bu da devreye zarar verebilir.
2. Sinek hazırlama platform direğini yukarıdan iki deveboynu ışık kılavuzu (Şekil 1A) ile (Faraday kafesinin içindeki soğuk ışık kaynağı ile) aydınlatın, böylece sinek tutucu yakın görsel kontrol altında direğe tercih edilen konuma yerleştirilebilir.
3. Sinek tutucuyu (içinde sinek varken!) sinek hazırlama platformu direğine monte edin. Sinek tutucuyu, sineğin sol gözü doğrudan araştırmacıya bakacak şekilde döndürün (Şekil 1B).
4. Preparasyonu stereomikroskop aracılığıyla gözlemlerken küçük bir kaba mikromanipülatör kullanarak künt referans elektrodu, sineğin ocelli'sinden nazikçe kafa kapsülüne yerleştirin (Şekil 1C). Elektrodu çok derine itmeyin, çünkü bu sinek beynine zarar verebilir.
   1. Alternatif olarak, referans elektrodu göğüs kafesinin arkasına yerleştirin. Her zaman sineğin sağlıklı göründüğünden (antenini hareket ettirdiğinden) ve gözlerinin sağlam olduğundan, kazara hasar görmediğinden emin olun. Hazırlık kusursuz görünmüyorsa, deneyler için yeni bir sinek hazırlayın.
5. Keskin kayıt mikroelektrodunu vazelin kaplı küçük bir açıklıktan sol göze sürün. Stereomikroskopta yüksek büyütme kullanın ve ışık kılavuzlarını ve odak düzlemini, elektrot ucu konumu yansıtma desenleriyle 3D olarak görünür hale gelecek şekilde hareket ettirin.
   NOT: Şekil 1D, fotoreseptör kayıtları için sineğin kafasının nasıl konumlandırılması gerektiğini (kayıt mikroelektrodunun göze girdiği açıya göre) göstermektedir. Elektrodu kırmadan göze sürmek deneyin en zor aşamasıdır. Elektrot ucu gözdeki küçük açıklığı kaçırır ve korneaya çarparsa, tipik olarak kırılır.
6. Mikroelektrot amplifikatörünü, her iki elektrot da sineğin vücut sıvıları ile elektriksel temas halinde preparatın içine sıkıca girdikten sonra açın.
7. Soğuk ışık kaynağını (Faraday kafesinin içinde) kapatın ve fişini prizden çekin. Toprak döngüsünün neden olduğu elektriksel gürültüyü en aza indirmek için fişini merkezi toprağa bağlayın ve kaz boynu ışık kılavuzlarını uzaklaştırın, böylece Kardan kolu sistemi sinek etrafında serbestçe hareket ettirilebilir. Sinek hazırlığının artık göreceli karanlıkta olduğundan emin olmak için oda ışıklarını kapatın.
8. Gözdeki kayıt elektrodunun direncini ölçün. Yalnızca direncin 100 - 250 MΩ.
   olduğu kayıt elektrotlarını kullanın not: <70 MΩ elektrot ile yüksek kaliteli hücre içi kayıtlar elde etmek neredeyse imkansızdır. Direnç <80 MΩ ise, elektrot ucunun kırılmış olması muhtemeldir. Bu durumda, amplifikatörü kapatın ve kayıt elektrodunu değiştirin.
9. Amplifikatörü akım-kelepçe (CC) veya köprü kayıt moduna ayarlayın. Sinyal ofsetini (kayıt voltajı) sıfıra ayarlayarak, her ikisi de artık elektriksel olarak birbirine bağlı hücre dışı boşlukta durduğundan, kayıt ve referans elektrotları arasındaki herhangi bir keyfi voltaj farkını iptal edin. Amplifikatörün ekran okumasını veya bir osiloskop ekranını kullanarak sinyal ofseti değişikliklerini takip edin.
10. Sinek gözünün karanlığa uyum sağlaması için 2-3 dakika bekleyin.
11. Kayıt elektrot ucunu 0,1 ila 1 mikronluk küçük adımlarla gözün daha derinlerine sürün. Bunu, uzaktan kumandalı bir mikro manipülatörün x ekseni piezo stepper'ı ile veya manuel bir manipülatörün ince çözünürlüklü düğmesini hafifçe döndürerek yapın.
12. Kayıt elektrodu dokuda ilerletilirken kısa (1 - 10 msn) ışık yanıp sönerek sinek gözünü uyarın.
    not: Kayıt elektrodu retinaya yerleştirilmişse ve göz normal şekilde çalışıyorsa, her ışık parlaması elektroretinogram (ERG) adı verilen voltajda kısa ve küçük bir düşüşe (0,2 - 5 mV hiperpolarizasyon) neden olur. Hücre dışı boşluğun alan potansiyelindeki bu değişiklik, retina hücrelerinin ışığa verdiği toplu tepkiden kaynaklanır.

Sonuçlar

Şekil 1. Deneyler için sinek tutucunun ve elektrotların konumlandırılması. (A-B) Sinek tutucu, aynı zamanda bir Peltier elemanı (A: ortada beyaz yuvarlak platform) aracılığıyla sıcaklık kontrolü sağlayan kayıt platformuna yerleştirilir. Kardan kolu, ışık kaynağı (sıvı veya kuvars fiber optik demet ucu) doğrudan gözüne bakacak şekilde, ışık uyaranının sineğin etrafında eşit bir mesafede (x, y dönüşü yo...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sinek hazırlığı yapmak için Stereo Zoom Mikroskobu	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF göz mercekleri: WHN30x-H/22	Uzun çalışma mesafesi ile ~ 150X büyütme yeteneğine sahip; ısmarlama ağır çelik masa montaj standı
Hücre içi kurulumda stereomikroskop	· Olimpos	Olympus SZX7; göz mercekleri: WHN30x-H/22	Elektrot ucunu küçük kornea deliğinden göze sürerken yansımalarını iyi görmek için 30X göz merceğine ihtiyaç vardır
Nikon mikroskobu	Nikon SMZ645; göz mercekleri: C- W30x/7
Titreşim Önleyici Tablo	Melles Griot	Breadboard üzerinde metrik M6 delikleri ile	Ismarlama makinelerimizde, sinek hazırlama platform direğine (elektronikli bakır bir soğutucu barındırır) aşağıdan girmesine izin veren kalın breadboard boyunca açılan büyük bir delik
Newport
Mikromanipülatörler	Narishige (Narishig)	Narishige NMN-21	Hücre içi kurulumlarımızda, shap kayıt elektrotlarını sinek gözüne sürmek için farklı mikromanipülatör sistemleri kullanılmaktadır. Listelenen tüm manipülatörler, Drosophila fotoreseptörlerinden ve LMC'lerden uzun süreli kararlı kayıtları başarıyla sağlamaktadır.
Huxley Bertram ·	İnce manuel kontrollü Huxley xyz ekseni
Sensapex (Duyarlılık)	Sensapex üç eksenli
Märzhäuser	Ek x ekseni piezo step ve MS 314 denetleyici ile Märzhäuser DC-314K
Manyetik Standlar	Açma / kapama anahtarlı herhangi bir manyetik taban yeterli olacaktır		Örneğin, Faraday kafesinin içindeki kabloları yönetmek için
Elektrot Tutucular	Harvard Aygıtı	ESP/W-F10N
Gümüş Tel	Dünya Hassas Aletler	AGW1510	0,3 - 0,5 mm çap; elektrot tutucular için klorlanması gerekir
Fiber Optik Işık Kaynağı	Olympus da dahil olmak üzere birçok farklı
Fiber Optik Demetler	UltraFine Teknolojisi		LED ışık uyarısını Kardan kol sistemine iletmek için. Hem sıvı hem de kuvars ışık kılavuzları kullanıyoruz (UV'den IR'ye kadar)
Diken Laboratuvarları
Sinek Kap Tüpü		P80-50P 50ml Cent. Tüp PP., 100'lü Paket	50 ml Plastik Santrifüj Tüpünün konik tabanını kesin ve üzerine 1 ml'lik bir pipet ucu yapıştırın.
Dijital Edinim Sistemi	Ulusal Enstrümanlar
Tek elektrotlu akım/gerilim-kelepçeli mikroelektrot amplifikatörü	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ Ürünler/Amplifikatörler/SEC-Tek- electrode-clamp/sec-10lx.html	Olağanüstü oyuncu!
Baş sahne	Standart (+/- 150 nA)	npi SEC-10LX için
LED ışık kaynakları ve sürücüleri	2 kanallı OptoLED (Cairn Research Ltd., Birleşik Krallık)		Teşvik sistemlerimizin çoğu şirket içinde inşa edilmiştir
Kendi kendine tasarlanmış ve inşa edilmiş
Satın Alma ve Analiz Yazılımı	Aralarından seçim yapabileceğiniz birçok şirket		Biosyst; Juusola laboratuvarında deneysel ve teorik çalışmalar için özel olarak yazılmış Matlab tabanlı sistem
Kişisel Bilgisayar veya Mac			PC veya Mac'in veri toplama sistemi ve yazılımıyla uyumlu olduğundan emin olun
Kardan kol sistemi	Kendi kendine tasarlanmış ve inşa edilmiş		Işık uyaranlarının doğru x,y,z konumlandırmasını sağlamak
Peltier sıcaklık kontrol sistemi	Kendi kendine tasarlanmış ve inşa edilmiş
Faraday Kafesi	Kendi kendine inşa edilmiş		Elektromanyetik gürültü koruması
Filamentli Borosilikat Cam Kılcal Damarlar		Dış çap: 1 mm
İç çap: 0,5 - 0,7 mm
Filamentli Kuvars Cam Kılcal Damarlar		Dış çap: 1 mm
İç çap: 0,5 - 0,7 mm
Pipet Çektirme	Sutter Enstrüman Şirketi	Model P-2000 lazer Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme	Borosilikat referans elektrotları için önceden ayarlanmış program #11'i (yama elektrotları) kullanın: Isı = 350; Filament = 4; Hız 36; Gecikme = 200).1.2.1). Borosilikat kayıt elektrotları için önceden ayarlanmış program #12'yi kullanın (bu genellikle fotoreseptör kayıtları için iyi geleneksel diyezleri çeker): Isı = 355; Filament = 4; Hız 50; gecikme = 225; Çekme = 150. Daha ince uçlara sahip elektrotlar gerektiren LMC kayıtları için bu değerlerin ayarlanması gerekir. Kuvars kılcal damarları çekmek için, P-2000 kılavuzu aşağıdakiler için programlar önerir İnce uçlu mikroelektrotlar. Bu programların önceden ayarlanmış parametreleri yararlı başlangıç noktaları olarak işlev görür iyi penetrasyon başarısı ve düşük kayıt gürültüsü ile elektrotlar üretmek için sistematik modifikasyonlar için.
Referans elektrot için Hücre Dışı Zil Çözeltisi	Fisher Scientific'ten Kimyasallar	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, Sakaroz	Protokol bölümündeki tarife bakın
Filamentli kayıt mikroelektrodunu doldurmak için 3 M KCl çözeltisi	Fisher Scientific'ten tuzlar	10010310, KCl
Vazelin	Vazelin

bulunur Serisi