İmmobilize Bir Zebra Balığı Larvasında Afferent Nöronlardan Gelen Elektrik Sinyallerinin İzlenmesi

Özet

Kaynak: Lunsford, E. T., et al. Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Nöronların Aktivitesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, felçli bir zebra balığı larvasındaki afferent nöronlardan gelen elektrik sinyallerinin, lateral hat ganglionunun yakınına bir mikropipet yerleştirerek ve sinyal yakalama için gevşek bir conta oluşturarak kaydedilmesini göstermektedir. Hücre dışı çözelti, bu işlem sırasında nöronal canlılığı korur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Elektrofizyolojik kayıtlar için malzemelerin hazırlanması

1. Silikon elastomer tabanlı bir kayıt kabı yapın.
   1. İnce bir tabaka halinde kendiliğinden karışan silikon elastomer bileşenleri (örn. Sylgard), sığ bir kuyunun kenarı ile aynı seviyeye gelene kadar cam tabanlı bir doku kültürü kabına dağıtın. Yaklaşık 0,5 mL yeterlidir.
   2. Çanağı örtün ve oda sıcaklığında en az 48 saat kürleyin.
2. Diseksiyon pimleri yapın.
   1. Bir DC güç kaynağı kullanarak, 100 mL'lik bir aşındırıcı beherine (3M KOH) negatif bir yük (5 V) sağlayın ve pozitif yüklü çıkışa bir tungsten tel (0,002 inç; 50,8 μm çap) bağlayın.
      Dikkat: Potansiyel bir yangın tehlikesi oluşturabilecek kıvılcım üretme riskiyle karşı karşıya kalabileceğiniz için bu prosedür sırasında negatif ve pozitif teller birbirine temas etmemelidir.
   2. Tungsten teli, uç keskin bir noktaya daralana kadar ucu hızlı ve tekrar tekrar aşındırma banyosuna daldırarak aşındırın. Stereomikroskop altında, düz kenarlı bir tıraş bıçağıyla teli uçtan yaklaşık 1 mm kesin. Üç kez daha tekrarlayın ve ardından ince forseps kullanarak pimleri kürlenmiş kayıt kabına yerleştirin.
3. Kayıt elektrotlarını hazırlayın.
   1. Kutu filamentli yatay bir mikropipet çektirme kullanarak, bir borosilikat cam kılcal tüpü (iç çap: 0.86 mm, dış çap: 1.50 mm) 30 μm çapında hafif konik uçlu elektrotlara çekin (Şekil 1 Ai) posterior lateral hattan afferent nöronları kaydetmek için kullanılacaktır.
   2. Ek bir borosilikat cam kılcal boruyu daha küçük uç çaplarına (1-5 μm) sahip bir çift elektrot içine çekin. Her iki elinizde bir elektrot tutarak, uçları ~ 30 ° 'lik bir açıyla kırmak için nazikçe birbirinin üzerinden geçirin. Bir mikro dövme kullanarak, eğimli ucu pürüzsüz olana kadar cilalayın.
4. Elektrofizyoloji kayıt programlarında protokolü oluşturur.
   1. Sağ kafa aşamasının, afferent nöron kayıtları için mikroelektrot akımı ve voltaj kelepçesinin arkasındaki Kanal 1 girişine bağlı olduğundan emin olun.
      NOT: Akım ve gerilim kelepçesi amplifikatörü için bilgisayar özellikleri en az 1 Ghz veya daha iyi bir işlemci, Windows XP Pro veya Mac OS X 10.46.6, 512 MB RAM'e sahip bir CD-ROM sürücüsü, 500 MB sabit disk alanı ve 2 USB bağlantı noktası gerektirir.
   2. Bilgisayar kontrollü amplifikatör yazılımını açın.
   3. Kanal 1'i akım-clamp IC düğmesine tıklayarak mod olarak ayarlayın.
   4. I-Clamp 1 sekmesinin altına aşağıdaki parametreyi girin. Birincil Çıkış: 100x AC Membran Potansiyeli (100.000 mV/mV), Kazanç: 1.000, Bessel: 1 kHz, AC: 300 Hz, Kapsam: Bypass. İkincil Çıkış: 100x AC Membran Potansiyeli (100 mV/mV), Kazanç: 1, Alçak geçiren filtre: 10 Hz.
   5. Kanal parametresini Ch1_Aff olarak kaydedin.
   6. Yama kelepçesi elektrofizyoloji yazılımını kurun ve açın.
   7. BNC koaksiyel kablosuyla amplifikatörün ilgili Kanal 0 Ölçekli Çıkışlarına bağlanan Sayısallaştırıcı Kanallarına (örneğin, Analog IN # 1 ve Analog IN #1) Ch1_Aff ekleyerek analog sinyalleri ayarlamak için Yapılandır'a tıklayın ve Lab Bench'i seçin. OK.
      'a tıklayın NOT: Sayısallaştırıcı için minimum bilgisayar gereksinimleri şunlardır: 1 Ghz veya daha iyi bir işlemci, Windows XP Pro veya Mac OS X 10.46.6, CD-ROM sürücüsü 512 MB RAM, 500 MB sabit disk alanı ve 2 USB bağlantı noktası.
   8. Al'a tıklayın ve Yeni Protokol'ü seçin.
   9. Mode/Rate (Mod/Hız) sekmesinde, Gap Free'yi seçin; Acquisition Mode (Edinme Modu) altında, Deneme Süresi'ni Use available disk space (yani durdurulana kadar kaydet) veya istenen bir set Duration (ss:dd:ss) olarak ayarlayın ve ardından çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için Sinyal başına örnekleme hızını (Hz) 20.000 olarak ayarlayın.
   10. Girişler sekmesi altında, daha önce yapılandırılmış olan Analog IN Kanallarını seçin (adım 1.4.6'da) ve ilgili kanal için Ch1_Aff seçin.
   11. Çıkışlar sekmesi altında, Kanal #0 ve Kanal #1 için sırasıyla Cmd 0 ve Cmd 1'i seçin.
       1. Amplifikatör üzerindeki Kanal 1 Komutunu BNC koaksiyel kablo ile sayısallaştırıcıdaki Analog Çıkış 0'a bağlayın.
   12. Kalan sekmeler varsayılan ayarlar altında kalabilir. Tamam'a tıklayın ve protokolü kaydedin.

2. Çözelti hazırlama

1. Hank'in çözeltisini hazırlayın: 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO₄, 4.2 mM NaHCO₄; pH 7.3. Stoka uygun hacimde deiyonize su ekleyerek %10 Hank solüsyonuna seyreltin.
2. Hücre dışı çözeltiyi hazırlayın: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2.1 mM CaCl₂, 10 mM glikoz ve 10 mM HEPES tamponu, pH 7.8 NaOH ile ayarlanır. Hücre dışı çözeltiyi 0.22 μm gözenek boyutuna sahip bir filtreden vakumla filtreleyin.
3. α -bungarotoksin hazırlayın: % 0.1 seyreltme elde etmek için 1 mg liyofilize α-bungarotoksini 10 mL hücre dışı çözelti içinde çözün.
4. Ötenazi çözeltisi hazırlayın:% 10 Hank çözeltisinde% 50 (mg / L) tamponlu farmasötik dereceli MS-222.
   DİKKAT: α-bungarotoksin, kolinerjik reseptörleri bloke ederek kasları felç eden güçlü bir nörotoksindir. Eldiven gereklidir ve felçli ile çalışırken göz koruması önerilir.

3. Elektrofizyolojik kayıtlar için larvaların hazırlanması

1. Zebra balığı larvalarını hareketsiz hale getirin.
   1. Laboratuvarda yetiştirilen zebra balığı popülasyonundan larvaları kullanın (Danio rerio; döllenmeden 4-7 gün sonra) ve 27 ° C'de embriyo çözeltisinde (% 10 Hank çözeltisi) barındırın.
   2. Büyük uçlu bir transfer pipeti kullanarak, larvaları yuvadan küçük bir Petri kabına (35 mm) aktarın ve çevredeki çözeltiyi mümkün olduğunca çıkarın.
      not: Embriyo çözeltisinin çıkarılması paralitiğin seyreltilmesini önler ve etkinliğini arttırır. Bir görev mendilinin köşesi, kalan embriyo çözeltisini uzaklaştırmak için kullanılabilir ve larvalarla temas etmemek veya onları havaya maruz bırakmamak çok önemlidir.
   3. Larvaları yaklaşık 5 dakika boyunca 10 μL<% 0.1 α-bungarotoksine daldırın > not: Larvaları hareketsiz hale getirmek için gereken süre preparatlar arasında değişir. Sağlıklı bir hazırlık, sürekli hızlı kan akışının ve azalmış motor yanıtların yakından izlenmesine bağlıdır. Felçliye kısa süreli aşırı maruz kalma, kapsamlı bir yıkamadan sonra bile preparatın genel sağlığında yavaş bir düşüşe neden olabilir. Larva tamamen hareketsiz hale gelmeden önce, hala ince kas titreşimleri belirtileri gösterirken bir yıkama uygulamak en iyisidir.
   4. Felçli larvaları hücre dışı solüsyonla yıkayın ve 10 dakika boyunca
      yıkayın not: Yıkama, larvaların ince kas titreşimlerinden tam felce geçmesine izin verir. Ayrıca, α-bungarotoksin, bu protokolün gözlemlediği endojen geri besleme devresinin kritik bir bileşeni olan nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) α9-alt biriminin bir antagonistidir; bununla birlikte, bu etkinin 10 dakikalık bir yıkamadan sonra Xenopus ve zebra balığı saç hücrelerinde geri dönüşümlü olduğu gösterilmiştir.
2. Balıkları kayıt kabına sabitleyin.
   not: Larva zebra balığı (4-7 dpf) hazırlanırken hayvan sağlığına müdahale ettiği için anestezi (örneğin, MS-222, Trikain) gerekli değildir. Aslında, larva zebra balığı bazı omurgalı protokollerinden muaftır.
   1. Bir transfer pipeti kullanarak larvaları hücre dışı solüsyon banyosundan silikon tabanlı kayıt kabına taşıyın. Çanağın geri kalanını hücre dışı çözelti ile doldurun.
   2. Stereomikroskop altında, larvaları ince uçlu forsepslerle silikon matın merkezinin üzerine, yanal tarafı yukarı bakacak şekilde, vücudun ön ve arka uçları sırasıyla soldan sağa doğru olacak şekilde nazikçe yerleştirin. Daha sonra ince uçlu forseps kullanarak silikon mattan kazınmış bir pimi kavrayın ve pimi silikona dik olarak larvaların dorsal notokordundan doğrudan anüse doğru yerleştirin. İkinci pimi kuyruğun ucuna yakın bir yerde notokorddan geçirin ve üçüncü pimi gaz kesesinin notokord sırtından geçirin (Şekil 1B).
      not: Pimleri yerleştirirken, kan akışını etkilemeyi veya çevredeki kas sistemine zarar vermeyi önlemek için notokord genişliğinin merkezini hedeflemek önemlidir. Notokord, posterior lateral çizgi sinirinin dorsalidir, bu nedenle uygun sabitleme ile lateral çizgi duyusal nöronlarında herhangi bir hasar beklenmez. Çevredeki dokuyu rahatsız etmeyecek şekilde ilk temastan sonra yerleştirin. İdeal olarak, pimin çapı, temiz bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için notokordun genişliğinin yarısından daha azdır. Pimler bu genişliği aşarsa, istenen pim genişliğine ulaşılana kadar adım 1.2'yi tekrarlayın. Sabitlemeden sonra kan akışı yavaşlarsa, adım 1.3'ten itibaren yeni bir örnekle tekrarlayın.
   3. Pim kapsülleyiciye girerken öne doğru hafif bir dönüş sağlarken dördüncü pimi otik vezikülden geçirin (Şekil 1B). Hafif bir rotasyon uygulanırken, afferent somata kümesini ortaya çıkarmak için kleithrum ve otik vezikül arasındaki dokuyu izleyin.
      not: Dördüncü pimin açılı olarak yerleştirilmesi, aksi takdirde büyük otik vezikül tarafından engellenen posterior lateral çizgi afferent ganglionun maruz kalmasını sağlamak içindir.

4. Afferent nöron kaydı

1. Afferent kayıt elektrodunu 30 μL hücre dışı çözelti ile doldurun, sağ kafa aşaması pipet tutucusuna (Şekil 1B, C) yerleştirin ve pnömatik bir dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basınç (1-2 mm Hg) uygularken çanak çözeltisine indirin.
2. Posterior lateral çizgi afferent ganglionunu bulun ve gevşek bir şekilde tutun.
   1. Bir mikromanipülatör kullanarak, afferent elektrot ucunu, kleitrumun üzerinde tutma pozisyonuna gelene kadar indirin.
   2. Büyütmeyi 40x daldırmaya yükseltin ve posterior lateral çizgi, sinir ve kleitrumun kesişimini bulun. Kleitrumdan anterior lateral çizgi sinirini, liflerin posterior lateral çizgi afferent ganglionu innerve ettiği yere kadar takip edin, ayrı soma kümesi ile ayırt edilebilir (Şekil 1F).
   3. Elektrot ucunu afferent ganglionun üzerine getirin ve uç epitele temas edene kadar pipeti indirin. Elektrotu nazikçe, tüm uç çevresi afferent ganglion ile temas edecek şekilde hareket ettirin.
   4. Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç (20-50 mm Hg) uygulayın ve basılı tutun.
      not: Afferent gangliona uygulanan negatif basınç yumuşaktır. Negatif basıncın arttırılması, sinyal-gürültüyü iyileştirebilir, ancak afferent nöron sağlığı, sürekli agresif emiş altında azalır ve bu da başarılı bir kayıt olasılığını azaltır.
3. Afferent nöron aktivitesini kaydedin.
   1. Sol kafa aşaması, yükseltilmiş sinyali, söz konusu sinyali bitişik bir bilgisayarda izlenecek yama kelepçesi elektrofizyoloji yazılımına veren bir sayısallaştırıcıya ileten amplifikatöre bağlanmalıdır.
   2. pClamp10'da, afferent nöronları izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın.
   3. Tüm hücrenin, afferent nöronların gevşek yama kaydının kendiliğinden, kabaca her 100-200 ms'de bir ani yükselmeler meydana geldiğinde elde edildiğinden emin olun (Şekil 1E).
   4. Yavaş yavaş, afferent nöron kayıt elektrot basıncını atmosferik (0 mm Hg) 'ye yükseltin ve kaydın geri kalanı için basılı tutun.

Sonuçlar

Şekil 1: Posterior lateral çizgi afferent nöron ve ventral motor kök aktivitesinin eş zamanlı elektrofizyolojik kaydı. (A). Gevşek yama afferent (i) ve ventral motor kök (ii) kayıt elektrotları örneği. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder. (B) Larva zebra balığı felç edilir ve stabiliteyi kaydetmek için dört yerde (haç sembolleri) bir...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mL beher	Borcam	1000	Etchant için hazne
10x suya daldırma hedefi	Olympus	UMPLFLN10xW	Larvaları konumlandırmak ve elektrot kaydetmek için düşük büyütme
40x suya daldırma hedefi	Olympus	LUMPLFLN40XW	Pozisyon elektrot ucu için daha yüksek büyütme ve yama kelepçesi oluşturma
BNC koaksiyel kablolar	Thor Laboratuvarları	2249-C-12	Amplifikatör ve sayısallaştırıcı kanallarının bağlanması; 4 gerektirir
Filamentli borosilikat cam kılcal damarlar	Warner Enstrümanları	G150F-3	İç çap: 0.86, dış çap: 1.50; Kayıt elektrotları oluşturmak için kullanılan kılcal cam
bilgisayar	Yok	Yok	Herhangi bir bilgisayar çalışmalıdır
DC Güç Kaynağı	Tenma Çiçeği	72-420	Diseksiyon pimlerini elektrikle aşındırmak için kullanılır
Elektrofizyoloji sayısallaştırıcı	Akson Aletleri, Moleküler Cihazlar	Akson Dijital Veri 1440A	Yama kelepçesi verilerinin alınmasını sağlar
Filament	Sutter Enstrüman Şirketi	FB255B	Mikropipet çektirmede kullanılan 2,5 mm kutu filament
İnce forseps	Güzel Bilim Araçları	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Ürün No. 11295-10	Larvaları manipüle etmek ve pimleri yerleştirmek için kullanılır
Sabit kademeli DIC mikroskobu	Olympus	BX51WI	Yama-kelepçe kayıtlarını görselleştirmek ve oluşturmak için kullanılan mikroskop
Esnek, konik pipet ucu	Balıkçı Bilimsel	02-707-169	Esnek uçlar, uçta hücre dışı çözeltiyi dağıtmak için kayıt elektroduna yerleştirilmesini sağlar
FloroDish	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	FD3510-100	Kapaklı cam tabanlı çanak kayıt kabı
KimWipe (KimSil	Kim Tech	34155	Larvalardaki fazla sıvıyı uzaklaştırmak için kullanılan görev mendili
Kwik-Gard	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	710172	Kendiliğinden karışan sylgard elastomer
Mikroelektrot amplifikatörü	Akson Aletleri, Moleküler Cihazlar	Çoklu Kelepçe 700B	Çift kanallı kayıtlar için yama kelepçesi amplifikatörü
Mikro Forge	Narishige (Narishig)	MF-830 mikro dövme	Kayıt elektrodunu parlatmak için
Mikromanipülatör kontrol ünitesi	Siskiyou	MC1000-eR/T	Mikromanipülatörü kontrol etmek için 4 eksenli kadran koordinatörü
Mikropipet çektirme	Sutter Enstrüman Şirketi	Alevli/Kahverengi P-97	Kılcal camı kayıt elektrotlarına çekmek için
Mikroskop kontrol ünitesi	Siskiyou	MC1000e	Mikroskobu sabit aşama ve hazırlık etrafında konumlandırır
Motorlu mikromanipülatör	Siskiyou	MX7600	Patch-clamp kayıt için headstage ve bağlı kayıt elektrodunu konumlandırır
MultiClamp Kumandası	Moleküler Cihazlar	2.2.2	Axon MultiClamp 700B Commander indirme sayfasından indirilebilir
Optik hava tablası	Newport Şirketi	VH3036W-OPT	Mikroskobu yüzdürmek ve kayıtlar sırasında titreşimleri en aza indirmek için breadboard izolasyon masası
pCLAMP	Moleküler Cihazlar	10.7.0	Axon pCLAMP 10 Elektrofizyoloji Veri Toplama ve Analiz Yazılımı İndirme sayfasından indirilebilir
Petri kabı	doğan	35-3001	Larvaları felçli içine daldırmak için kullanılır
Pipet tutucu	Moleküler Cihazlar	1-HL-U	Kayıt elektrodunu tutun ve ana panele bağlanın.tage
Pnömatik dönüştürücü	Fluke Biyomedikal Cihazlar	DPM1B	Kayıt elektrodu iç basıncını kontrol etmek için
Potasyum hidroksit	Sigma-Aldrich	221473-25G	Diseksiyon pimlerini aşındırmak için dağlayıcı
Silikon boru	Tygon Gölü	14-169-1A	Pnömatik dönüştürücüyü pipet tutucuya bağlamak için hortum
Stereomikroskop	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Pim uçlarını görselleştirmek için ve larvaların hazırlanması sırasında kullanılır
Düz kenarlı tıraş bıçağı	Canopus	amazon.com'den Sipariş	Diseksiyon pimleri yaparken tungsten telini keser
şırınga	Becton Dickinson Bileşimi	309602	Kayıt elektrotlarına enjekte etmek için hücre dışı çözelti ile doldurulmuş
Transfer pipeti	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Larvaları aktarmak için tek kullanımlık, steril olmayan pipet
Trikain metansülfonat	Syndel (Türkçe)	12854	Larvaları yüksek dozda ötenazi yapmak için kullanılan farmasötik aneasthetic.
Tungsten tel	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	715500	0,002 inç, 50,8 μm çap; diseksiyon pimleri yapmak için kullanılır
Vakum filtrasyon ünitesi	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Elektrofizyoloji elektrot zil sesi için kullanılan hücre dışı solüsyonu sterilize etmek için kullanılan tek kullanımlık, steril, vakumlu filtrasyon üniteleri
Gerilim kelepçesi akım kelepçesi kafa sahnesi	Moleküler Cihazlar	Özgeçmiş-7B	Sol ve sağ headstage olarak kullanılan MultiClamp 700B amplifikatör ile birlikte verilir
α-bungarotoksin	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	B1601	Kayıttan önce larvaları hareketsiz hale getirmek için

Serisi arası Serisi ) Teknolojisi Belediyesi Belediyesi Teknolojisi Belediyesi Serisi arası Gazetesi · Gazetesi Gazetesi Serisi