Koronal Hipokampal Dilimlerde Uyarılmış Potasyum İyonu Konsantrasyon Dinamiğinin Ölçümü

Özet

Kaynak: Octeau, J. C. et al. Yetişkin beyninin doku dilimlerinde potasyum iyonu seçici mikroelektrotların yapımı, test edilmesi ve kullanılması. J. Vis. Uzm. (2018).

Video, fare koronal hipokampal beyin dilimlerinin elektriksel stimülasyonu üzerinde uyarılmış potasyum iyonu konsantrasyon dinamiklerini göstermektedir. Hipokampustaki CA3 bölgesinin stratum radiatumuna bir bipolar uyarıcı elektrot yerleştirilir ve CA1 stratum radiatumuna bir potasyum iyonu seçici elektrot yerleştirilir. Elektriksel stimülasyon, potasyum iyonu salınımına neden olan bir aksiyon potansiyeline neden olur. Son olarak, bir inhibitör molekülün varlığında uyarılmış potasyum iyonu tepkisinin olmaması, potasyum iyonu konsantrasyon dinamiklerinin Schaffer teminatlarında aksiyon potansiyeli oluşumundan kaynaklandığını doğrular.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Akut Hipokampal Beyin Dilimlerinin Hazırlanması

1. Dilim çözeltilerinin hazırlanması
   1. 194 mM sükroz, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glikoz, 1 mM MgCl₂, 1.2 mM NaH₂PO₄ ve 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm'den oluşan 500 mL sükroz kesme çözeltisi hazırlayın.% 95 O₂ ve% 5 CO₂ ile doyurulmuş.
   2. 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glikoz, 2 mM CaCl₂, 1.2 mM NaH₂PO₄ ve 26 mM NaHCO₃; pH 7.3 - 7.4 (köpürme sonrası), 290 - 300 mOsm,% 95_O2 ve% 5 CO₂ ile doymuş. Beyin dilimi tutucu haznesi içeren bir beheri kayıt solüsyonu ile doldurun ve 32-34 °C'de tutun. Vibratom haznesini buzlu su rüşveti ile doldurun.
2. Akut dilim hazırlama
   1. Bir fareyi 2-3 mL izofluran ile önceden yüklenmiş bir çan kavanozuna yerleştirerek derinlemesine uyuşturun. Ayak parmağını kıstırma refleksini kontrol edin ve yanıt vermiyorsa, hayvan protokolünüzün gerektirdiği şekilde bir çift keskin makas veya giyotin kullanarak hızlı bir şekilde kafasını kesin.
   2. Kafa derisini orta hat boyunca kesmek için kafatasının kaudal kısmından makas kullanarak 2-3 cm'lik bir kesi yapın. Kafa derisini manuel olarak geri çekerken, kafatasının kenarları boyunca foramen magnumdan iki adet 1 cm'lik yatay kesi yapın. Daha sonra, ince makaslar kullanarak, kafatasının arkasından buruna kadar orta hat boyunca kafatası uzunluğunda bir kesi açın.
   3. Orta çizginin yakınına yerleştirilen ince forseps kullanarak, kesilen kafatasını iki parça halinde geri çekin. Fare beynini kafatasından çıkarın ve sırasıyla beynin kaudal ve rostral kısımlarında bulunan beyincik ve koku soğancıklarını çıkarmak için bir bıçak kullanın. Bunlar, onları korteksten ayıran büyük çatlaklarla tanımlanabilir.
   4. Süper yapıştırıcı kullanarak beyin bloğunu vibratom tepsisine monte edin. Vibratom tepsisini buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile doldurun.
   5. Koronal düzlemde doku kesitlerini 300 μm kalınlığında kesin. Genellikle 6 koronal hipokampal dilim toplanabilir.
   6. Her bölüm kesildikten sonra, dilimleri hemen 32-34 ° C'ye ısıtılmış dilim tutma kabına aktarın. Bölümleri içeren beheri çıkarmadan önce bölümleri 20 dakika bu sıcaklıkta tutun ve kayıttan önce en az 20-30 dakika oda sıcaklığında tutun.

2. Elektriksel Olarak Uyarılan K⁺ Dinamiğinin Ölçümü

1. Dilim hazırlamanın ayarlanması
   1. Beyin dilimini bir Pasteur pipeti kullanarak banyoya nazikçe yerleştirin ve naylon ipli bir platin arp ile nazikçe yerinde tutun.
   2. Bipolar uyarıcı elektrotun uçlarının birbirine paralel olduğundan ve dilim düzlemi ile aynı hizada olduğundan emin olun. Yavaşça, 6-7 saniye boyunca, Schaffer teminatlarını uyarmak için elektrotları yaklaşık 40-50 μm derinliğinde CA3 stratum radiatumuna yerleştirin. Koronal kesitlerde, CA3 yaklaşık olarak hipokampusun hipokampal genustaki granül hücre tabakasına uygun lateral kısmı olarak tanımlanabilir ve stratum radiatum medial ve ventral olarak piramidal hücre tabakasına düşer.
   3. Elektrodu yaklaşık 3-4 saniye boyunca yavaşça indirerek, K⁺ seçici elektrodu yaklaşık 50 μm derinliğindeki CA1 stratum radiatumuna dikkatlice yerleştirin. Dilime stimülasyon uygulamadan önce elektrot boyunca potansiyelin stabilize olmasına izin verin: bu genellikle 5 ila 10 dakika sürer. Dilim hücre dışı K ⁺ 'da kendiliğinden değişiklikler gösteriyorsa, atın ve bu işlemi yeni bir dilimle tekrarlayın.
2. Uyarılmış K⁺ salınımını ölçün
   1. Yanıtları dijital olarak kaydederken stimülatör üzerindeki tetiğe manuel olarak basarak elektriksel stimülasyon trenleri (8 darbe) uygulayın. 10 μA uyaran genliğinden başlayarak 10 Hz ve 1 ms darbe genişliğinde stimülasyon uygulayın.
   2. Maksimum K ⁺ yanıt genliği tespit edilene kadar 2 kat artan stimülasyon genlikleri uygulayın. Herhangi bir yanıt görmüyorsanız, K⁺ elektrodunun konumunu stimülasyon bölgesine 100 μm'lik artışlarla yaklaştırın
   3. Yarı maksimal yanıtı üreten uyaran genliğini belirleyin. Deneyimlerimize göre bu, hazırlama kalitesine, hayvanın yaşına ve stimülasyon elektrotları ile K ⁺ seçici elektrot arasındaki mesafeye bağlı olarak 40-160 μA arasındadır.
   4. Aynı dilimde, yarı maksimal yanıtı üreten genlikten bir adım daha düşük bir uyaran genliği kullanarak (örneğin, 80 μA yarı maksimal bir yanıt üretiyorsa, 40 μA kullanın) artan sayıda darbenin uyaran trenlerini uygulayın. Başlangıçta 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 ve 128 darbeli trenler kullandık.
   5. K ⁺ sinyallerine, elektrikle uyarılan Schaffer teminat banyosunun aksiyon potansiyeli ateşlemesinin aracılık ettiğini doğrulamak için, ACSF'de 10 dakika boyunca 0,5 μM tetrodotoksin (TTX) uygulayın ve stimülasyon protokolünü tekrarlayın. Uyarılmış tepkiler gözlenmemelidir.
   6. Dilim deneyini bitirdikten sonra, elektrodu kalibrasyon çözeltilerinde yeniden kalibre ederek ve yanıtın ilk kalibrasyondan %10'dan fazla sapmadığından emin olarak elektrotun güvenilirliğini koruduğunu onaylayın

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Vibratom	DSK (Türkçe)	Mikro Dilimleyici Sıfır 1
Fare: C57BL/6NTac kendi içinde yetiştirilmiş fareler	Taconic (özlü	Hisse Senedi#B6
mikroskop	Olympus	BX51
pCLAMP10.3	Moleküler Cihazlar	Yok
Özel mikrofil 28G uç	Dünya hassas enstrümanlar	CMF28G
Tungsten Çubuk	A-M Sistemleri	716000
Bipolar uyarıcı elektrotlar	FHC (Doğa Hizmetleri)	MX21XEW(T01)
Uyaran izolatörü	Dünya hassas enstrümanlar	A365 Radarı
Çim S88 Stimülatörü	Çim Aletleri Şirketi	S88 Serisi
Borosilikat cam pipetler	Dünya hassas enstrümanlar	1B150-4
A'dan D'ye kart	Dijital veri 1322A	Akson Aletleri
Sinyal Amplifikatörü	Çoklu kelepçe 700A veya 700B	Akson Aletleri
Sahne Başı	CV-7B Kedi 1	Akson Aletleri
Bilgisayarı yama	Dell	Yok
Sodyum Klorür	Sigma	S5886 Serisi
Potasyum Klorür	Sigma	P3911 Serisi
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H3375
Sodyum Bikarbonat	Sigma	S5761 Serisi
Sodyum Fosfat Monobazik	Sigma	S0751 Serisi
D-glikoz	Sigma	G7528
Kalsiyum Klorür	Sigma	21108
Magnezyum Klorür	Sigma	M8266
valinomisin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimetil-3-nitrobenzen	Sigma	40870-25ml
Potasyum tetrakis (4-klorofenil)borat	Sigma	60591-100mg
Heptan içinde% 5 dimetildiklorosilan	Sigma	85126-5ml
TTX (Türkçe)	Cayman Kimya Şirketi	14964
hidroklorik asit	Sigma	H1758-500 milyon
Sakaroz	Sigma	S9378-5kg
Pipet Mikromanipülatörü	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objektif lens	Olympus	PlanAPO 10xW