$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>NOT: Q175 vahşi tip (WT) ve heterozigotlardan (HET'ler) yapılan kayıtlar her yaş ve cinsiyette yapılabilir. Burada 51 ila 76 haftalık erkek ve kadınları inceledik.
1. Kortikostriatal Aksonlarda Ekspresyon için Glutamat Sensörü iGluu'nun Enjeksiyonu
- Virüsün enjeksiyonu için borosilikat cam pipetleri hazırlamak için pipet çekiciyi (tek adımlı mod) kullanın. Çektikten sonra, 30-50 μm'lik bir uç çapı elde etmek için pipeti manuel olarak kırın. Kafatasını açmak için matkap da dahil olmak üzere pipet ve cerrahi aletleri otoklavlayın.
- AAV9-CaMKIIa.iGluu virüsünü saklayın. WPRE-hGH (7.5 x 1013gc / mL) -80 ° C'de 10 μL alikotlarda. Enjeksiyonlar virüs üretiminden kısa bir süre sonra (6 ay içinde) yapılırsa, 5 ° C'de tutun. Ameliyattan önce şişeyi çıkarın ve oda sıcaklığında tutun.
- Cam pipeti doldurun ve kabarcıkları çıkarın.
- Hayvanı, 87.5 mg / kg ketamin ve 12.5 mg / kg ksilazin içeren bir çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Ek ağrı kesici için deri altında% 0.25 bupivakain (8 mg / kg) enjekte edin. Kas tonusunu izleyerek ve ağrıya bağlı reflekslerin yokluğunu gözlemleyerek anestezi derinliğini kontrol edin.
- Kafadaki cildi tıraş edin ve% 70 alkolle sterilize edin. Fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- Cildi çıkarmak için bir neşter ve motor korteksin üzerindeki kemikte 1,2 mm'lik bir delik açmak için yüksek hızlı (38.000 rpm) bir matkap kullanın.
- Şırıngayı, takılı enjeksiyon pipeti ile hassas bir manipülatörün tutucusuna monte edin. Dikey olarak yönlendirilmiş pipeti kortekse 4 farklı yerden yerleştirin. Enjeksiyon koordinatları, bregmaya göre (mm cinsinden): anterior 1.5, lateral 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. Dura mater'e göre derinlik (mm cinsinden): 1.5–1.7'dir.
- Enjeksiyon sistemini kullanarak, seyreltilmemiş virüs çözeltisinin her yerine 0.05 μL / dak hızla 0.05 μL enjekte edin. Her enjeksiyondan sonra, pipeti yavaşça geri çekmeden önce (1 mm / dak) 1 dakika yerinde bırakın.
- Ameliyat yarasını naylon bir dikişle kapatarak bitirin.
- Fareyi orijinal kafesine geri koymadan önce temiz bir kafeste bir ısıtma yastığı üzerinde 0,5 ila 1 saat bırakın.
- Akut beyin dilimlerinin hazırlanmasından önce fareyi 6 ila 8 hafta boyunca 12 saatlik gündüz-gece döngüsünde tutun.
not: Hücre hasarı ve sinaps kaybıyla sonuçlanan bağışıklık reaksiyonlarını önlemek için, çoklu viral yapıların enjeksiyonu aynı anda veya birincil enjeksiyondan 2-3 saat sonra yapılmalıdır. iGluu enjeksiyonu için koordinatlar Paxinos ve Franklin beyin atlasına göre seçildi. M1 motor korteksine karşılık gelirler. Enjekte edilen beyinlerin immün boyama, ipsi ve kontralateral striatumda ve kontralateral M1 ve S1 kortekslerinde çok sayıda ancak çoğunlukla iyi izole edilmiş aksonlar ve akson varislerini görselleştirdi.
2. Glutamat Sensörünü İfade Eden Glutamaterjik Terminalleri Arayın iGluu
- Kalibrasyon modu
- sCMOS kamerayı ve kamera kontrol yazılımını aşağıdaki ayarlarla hazırlayın. Okuma sayfasında ayarlanan Piksel okuma hızı: 560 MHz (= en hızlı okuma), Hassasiyet/Dinamik Aralık: bit, Sahte Gürültü Filtresi: Evet, Örtüşme Okuması: Evet. Gruplama/ROI sayfasında Tam ekran'ı seçin.
- Bir lamel altında 5 mg / mL Lucifer Yellow (LY) damla içeren bir cam slayt hazırlayın.
- LY slaytını 63x objektifin altına yerleştirin, lazer deklanşörü açın ve aşağıdaki ayarları kullanarak bir seri çekim gerçekleştirin: Piksel Gruplama: 1x1, Tetikleme modu: Dahili, Pozlama süresi: Minimum (belirlenecek).
- Lazer gücünü, 4 μm çapında bir floresan noktası oluşturacak şekilde ayarlayın (görüntü doymuş pikseller içermemelidir).
- Lazer konumlandırma sisteminin kalibrasyonunu yapmak için lazer konumlandırma yazılımında aşağıdaki ayarları seçin: Nokta boyutu çapı: 10, Tarama hızı: 43.200 kHz. Sağ paneldeki Görüntü alımını başlat düğmesine tıklayın. Çalıştırmalar: 0, Çalıştırma gecikmesi: 0'ı ayarlayın ve Sıra sayfasında TTL'de Çalıştır seçeneğini belirleyin. Kalibrasyon sayfasındaki Kalibre Et düğmesine tıklayın ve lazer kontrol yazılımını, alım ekranının sol üst köşesinde gösterilen talimatlara göre kalibre edin.
- Kurulum, kamera ve lazer kontrolü için bağımsız bir yazılım kullanıyorsa, kamera edinme penceresinden ekran görüntüleri alın ve XY koordinatlarının yeniden hesaplanması için lazer kontrol yazılımına gönderin. Yazılım farklı bilgisayarlara yüklenmişse, görüntüyü lazer kontrol yazılımına aktarmak için bir video yakalayıcı kullanın. Lazer kontrol yazılımı, XY ölçeklendirme faktörleri ve ofsetleri hakkındaki bilgilere ihtiyaç duyacaktır. Bu amaçla, lazer kontrol programının alım penceresi içinde görüntünün sol üst, sol alt ve sağ alt köşelerinin koordinatlarını belirleyin. Ölçeklendirme faktörlerini aşağıdaki denklemlere göre hesaplayın: X faktörü = (X sağ alt – X sol alt)/2048, X ofset = X sol alt, Y faktörü = (Y sol üst – Y sol alt)/2048, Y ofset = Y sol alt.
- Kalibrasyon prosedürünün sonunda, 267x460 piksellik dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) oluşturun, ekranın ortasına taşıyın ve Sırayı başlat düğmesine tıklayın.
- Aşağıdaki fotoğraf makinesi kontrol yazılımı ayarlarına geri dönün: Gruplama: 2x2, Tetikleme modu: Harici pozlama, Pozlama süresi: Minimum (belirlenecek).
- Otomatik floresan düzeltme modu
NOT: Aktif sinaptik terminallerin ortamındaki [Glu]'nun dinlenme seviyesi tipik olarak 100 nM'nin altındadır. Buna göre, herhangi bir glutamat sensörü, özellikle iGluu gibi düşük afiniteli bir sensör, sinaptik glutamat salınımı olmadığında oldukça sönük olacaktır. Bununla birlikte, bazı iGluu floresansı istirahatte bile tespit edilebilir, ancak doku otofloresansından ayırt edilmelidir. 473 nm aydınlatma, hem iGluu floresan hem de otofloresan ortaya çıkarır (Şekil 1A-C). İkincisi geniş bir dalga boyu aralığını kaplarken, iGluu floresan 480-580 nm ile sınırlıdır (maksimum 510 nm'de). Otofloresan düzeltmesi, farklı yüksek geçiren filtrelere sahip iki görüntünün elde edilmesine dayanır.
- Beyin dilimlerini başka bir yerde anlatıldığı gibi önceden hazırlayın. Kepek dilimlerini hazır tutun.
- Dilimleri, 125 mM sodyum klorür (NaCl), 3 mM potasyum klorür (KCl), 1.25 mM di hidrojen sodyum fosfat (NaH2PO4), 25 mM sodyum bikarbonat (NaHCO3), 2 mM kalsiyum klorür (CaCl2), 1 mM magnezyum klorür (MgCl2), 0.5 mM sodyum piruvat, 2.8 mM sodyum askorbat ve 0.005 mM glutatyon ile desteklenmiş 10 mM glikoz (pH 7.3, 303 mOsm/L). 1–2 mL/dk'lık bir akış hızı kullanın. Banyo sıcaklığını 28–30 °C'de tutun.
- Dorsal striatumu 20x suya daldırma hedefi altında bulun. Doku hareketini en aza indirmek için dilimleri naylon bir ızgara ile platin bir arp üzerine sabitleyin. 63x /NA 1.0 suya daldırma hedefine geçin. Işığı 473 nm'de (dikroik ayna) yansıtan ve dalga boylarında >510 nm) geçiren ışığı (emisyon filtresi) seçin.
- İlgili kontrol yazılımıyla bir Analog-Dijital (AD)/Dijital-Analog (DA) (AD/DA) kartı kullanarak aydınlatma, stimülasyon ve görüntü alımını senkronize edin. Tetikleme programını, 180 ms'lik bir lazer pozlama süresi ve 160 ms'lik bir görüntü alma süresi ile alımı kontrol edecek şekilde ayarlayın. Lazer ışınını önceden belirlenmiş sayıda noktaya göndermek için lazer konumlandırma cihazını kullanın ve Tarama hızı ve Nokta boyutu ayarlarını tanımlayın.
- 510 nm'de yüksek geçiren bir filtre kullanarak hem otofloresan hem de iGluu-pozitif yapıların bir görüntüsünü elde edin ("sarı görüntü").
- 600 nm'de yüksek geçiren bir filtre kullanarak tek başına otofloresan ile bir görüntü elde edin ("kırmızı görüntü").
- Aralığı tanımlamak için en parlak 10 pikselin ve en koyu 10 pikselin ortalama yoğunluklarını kullanarak kırmızı ve sarı görüntüleri ölçeklendirin. "Sarı eksi kırmızı görüntü" çıkarma işlemini gerçekleştirin ve ilgilenilen bouton'un uygun şekilde görselleştirilmesi için standart bir 8 bitlik tif dosyası oluşturmak için çıkarılan görüntüyü yeniden ölçeklendirin (Şekil 1D). iGluu-pozitif yapılardan parlak pikseller, arka plandan gri pikseller ve otofloresan yapılardan koyu pikseller içerir.
not: Verilen ekipmanla ortalama dinlenme floresansı (F) 700 AU'nun altında olacaktır.
- Bouton arama modu
NOT: iGluu-pozitif pikseller, farklı sıradaki akson dalları, çatallanma bölgeleri, vezikül tükenmesinden sonraki varisler veya tamamen aktif varisler gibi aksonal ağacın işlevsel olarak farklı elemanlarına ait olabilir. Bununla birlikte, fonksiyonel sinaptik terminalleri sadece görsel inceleme ile tanımlamak neredeyse imkansızdır. Bu nedenle, her glutamaterjik sinaptik terminalin, elektriksel depolarizasyona duyarlılığı ile tanımlanması gerekir. Stimülasyona cevap vermeyen bölgeler atılmalıdır. Kortikostriatal aksonlardan glutamat salınımını indüklemenin fizyolojik yolu, bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmaktır. Bu, uygun spektral özelliklere sahip bir kanal rodopsin kullanılarak veya iGluu'nun kendisi tarafından görselleştirilen bir aksonun elektriksel stimülasyonu ile elde edilebilir. Yanlışlıkla opsin aktivasyonunu önlemek için, ikinci uygulamayı tercih ettik
- Borosilikat cam kılcal damarlardan stimülasyon pipetleri üretmek için mikropipet çekiciyi (dört aşamalı modda) kullanın. İç uç çapı yaklaşık 1 μm olmalıdır. ACSF ile doldurulduğunda, elektrot direnci yaklaşık 10 MΩ olmalıdır.
- Aynı aksona bağlı bir dizi sinaptik boutondan glutamatın aksiyon potansiyeline bağlı salınımını indüklemek için, bir floresan varikozluğunun yanına bir cam stimülasyon elektrodu yerleştirmek için 63x büyütme, 510 nm emisyon filtresi ve çıkarılan görüntüyü kullanın. Ek aksonların yakınlığından kaçının.
- Stimülasyon pipetine depolarize akım darbeleri iletmek için stimülatörü açın. 2 μA (10 μA'dan fazla değil) civarında akım yoğunlukları kullanın.
- Bir kanalın standart banyo solüsyonunu sağladığı ve diğer kanalların gerekli iyon kanalları, taşıyıcılar veya membran reseptörleri blokerlerini sağladığı çok kanallı banyo uygulama sistemini açın. Kayıt alanındaki akışı kontrol edin ve ardından tetrodotoksin (TTX) kanalına geçin (banyo solüsyonu artı 1 μM TTX). 2-3 dakika sonra, ilgi bulonu tekrar canlandırın, ancak şimdi aksiyon potansiyeli oluşumu yokluğunda. Serbest bırakma doğrudan voltaja bağlı kalsiyum kanallarından kalsiyum akışından kaynaklanır.
- Stimülatör üzerindeki yoğunluk anahtarını çevirerek, aksiyon potansiyelleri aracılığıyla ortaya çıkanlara benzer tepkiler elde etmek için stimülasyon akımını ayarlayın. Tipik olarak, stimülasyon akımı 0,5 ms'lik bir depolarizasyon için yaklaşık 6 μA olacaktır.
- Preparatın temel testi için 0.5 mM CdCl2 uygulayın. Bu kalsiyum kanal blokeri glutamat salınımının varlığı, sinaptik glutamat salınımını tamamen önler, böylece doğrudan uyarılan glutamat sinyalinin kalsiyum bağımlılığını doğrular.
not: Aşağıdaki genel öneri, striatumdaki tek sinaps deneylerinin başarı oranını artırmaya yardımcı olabilir. Sağlam salım mekanizmasına sahip glutamaterjik sinaptik terminalleri seçmek için, bir varisite şunları yapmalıdır: (i) Düzgün bir mil benzeri şekle sahip olmalıdır; (ii) Bir akson çatallanması ile ilişkili olmamak; (iii) "Sarı görüntü" üzerindeki diğer yapılardan daha parlak olmalıdır; (iv) Fiber yollardan ziyade striatal nöropilde bulunur; (v) Çok ince bir akson dalı üzerinde bulunmak; (vi) Dilimin daha derin kısımlarında bulunmamalıdır.
3. Glutamat Salınımı ve Klirensinin Görselleştirilmesi
- Kayıt modu
NOT: Otofloresansın çıkarılmasından (adım 2.2) ve ilgilenilen bouton'un yanıt verebilirliği için birkaç başlangıç testinden (Adım 2.3) sonra, veri toplama başlayabilir. Tek akson terminallerinden glutamat salınımının elektriksel aktivasyonuna verilen yanıtlar, daha fazla analiz aracı uygulanmadan doğrudan görüntüde gözlemlenebilir (Şekil 2). Bununla birlikte, sinaps performansının bazı temel göstergelerini hemen çıkarmanın çok uygun olduğu kanıtlanmıştır (Şekil 3). Bu bilgi, belirli terminal tiplerinin seçimi, HD ile ilgili değişikliklerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesi, süperfüzyon sistemi ile uygulanacak denemelerin veya ilaçların sayısı ve sıklığı gibi sonraki deney süreci hakkında kararlar almak için gereklidir. Sonunda ortaya çıkan eserlerle uğraşmak da gerekli olabilir. İlk olarak, veri kaydı için standart ayarlar açıklanmıştır.
- Mikroskop XY sürücülerini kullanarak, test edilmiş iGluu-pozitif bouton'u görüş alanı merkezine yakın bir yere yerleştirin. Almayı iptal et düğmesiyle görüntü alımını durdurun. Son alınan resimde, farenin sol tuşu ile üzerine tıklayarak dinlenme bouton merkezinin XY konumunu belirleyin. Ayarlanan imlecin XY koordinatları, alım penceresinin alt durum panelinde gösterilecektir.
- Kalibrasyon verilerini kullanarak (adım 2.1.6), iGluu floresansının uyarılması için lazer ışınının gönderilmesi gereken yerin koordinatlarını hesaplayın. Aşağıdaki denklemleri kullanın: X lazer = X kamera * X faktörü + X ofseti, Y lazer = Y ofseti – Y kamera * Y faktörü. Bu yeniden hesaplamayı gerçekleştirirken, kameranın dikey veya yatay çevirme ayarlarına dikkat edin.
- Hesaplanan koordinatları kullanarak lazer kontrol yazılımında tek noktalı bir dizi oluşturun. Bunun için, lazer kontrol yazılımının Sıra sayfasındaki Sıraya ekle kutusunda Nokta'yı seçin. Tetikleme gecikmesinin başlaması için 10 μs ve lazer darbe süresi için 180 ms seçin. Fareyi hesaplanan koordinatlara getirin ve sol düğmeye tıklayın.
- Lazer kontrol yazılımında aşağıdaki ayarları seçin: Çalışır: 0, Çalışma gecikmesi: 0, Sıra: TTL'de çalıştır. Ardından Sırayı başlat'ı tıklayın.
- Kamera kontrol yazılımında aşağıdaki ayarları seçin: Gruplama/ROI sayfasında, Görüntü Alanı: Özel, Piksel Gruplama: 2x2, Yükseklik: 20, Genişlik: 20, Sol: Dinlenme iGlu u-pozitif noktanın X koordinatı eksi 10 piksel, Alt: Dinlenme iGluu-pozitif noktanın Y koordinatı eksi 10 piksel, Çekim Modu: Kinetik Seri,Kinetik Seri Uzunluğu: 400, Pozlama Süresi: 0.0003744s (minimum değer). Bu tür ayarlarla, edinme hızı 2.48 kHz olacaktır.
- Tetikleme modu: Harici'yi seçin. Kamera kontrol yazılımında Sinyal al öğesine tıklayın. Tetikleme cihazı için belirlenen deneysel protokolü başlatın.
- Deneysel protokol Denemesini aşağıdaki zaman çizelgesiyle uygulayın: 0 ms – denemeyi başlat, 1 ms – lazer aydınlatmayı başlat, 20 ms – kamera ile görüntü almayı başlat, 70 ms – elektrik stimülasyonunu başlat 1, 120 – elektrik stimülasyonunu başlat 2, 181 ms – denemeyi bitir (lazer ve kamera kapalı). Böylece, bir deneme sırasında kamera 2.48 kHz frekansında 400 kare elde eder. 2.3.3 ve 2.3.5 adımlarına bakın. Elektrik stimülasyonu ile ilgili ayrıntılar için.
- Presinaptik vezikül havuzlarının yeterli şekilde toparlanmasını sağlamak için, 0.1 Hz veya daha düşük bir tekrarlama frekansı ile Deneme protokolünü uygulayın.
- Patolojik sinapsların tanımlanması için glutamat geçici durumunun çevrimdışı inşası ve glutamat salınımının ve klerensinin hızlı değerlendirilmesi
- Değerlendirme rutinlerini açın. Burada, şirket içinde yazılmış bir yazılım olan SynBout v. 3.2'yi kullanıyoruz. (yazar: Anton Dvorzhak). Şekil 2'deki videoda olduğu gibi yükseltilmiş iGluu floresansına sahip piksellerden bir ΔF/F geçici durumu oluşturmak için aşağıdaki adımlara ihtiyaç vardır.
- Buton boyutunu belirlemek için, stimülasyonun başlamasından önce dinlenme sırasında (F) ROI floresan yoğunluğunun ortalama ve standart sapmasını (SD) hesaplayın. Piksellerin kapladığı alanı F>ortalama + 3 SD ile belirleyin ve kutulayın (Şekil 3A). Eşik üstü alanın dairesel bir formunu varsayarak sanal bir çap (μm cinsinden) belirleyin.
- Tepe yoğunluk değeri ile F arasındaki fark olarak ΔF'yi belirleyin. Uyarıcı akımı ve ΔF/F'yi zamana karşı çizin (Şekil 3B). Dinlenme durumunda (stimülasyonun başlamasından önce) ΔF/F'nin SD'sini ve "Tepe genliğini" hesaplayın. Tepeden bozunma için monoüstel uydurma yapmak için 3 SD ΔF/F'den daha fazla tepe genliğine sahip piksel kullanın. ΔF/F'nin bozunma TauD'sinin zaman sabitini belirleyin.
- Belirli bir sinapsta "Maksimum genliği" tahmin etmek için, en yüksek ΔF/F değerine sahip pikseli seçin. Tipik olarak dinlenme bouton iGluu floresan sınırlarının içinde veya yanında bulunur. "Maksimum genlik", tek bir sinapsın temizleme makinesine sunulan glutamat yükünün en iyi göstergesi olacaktır.
