Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cerrahi
- Elektrofizyolojik kayıtlar için, anestezi için üretan (DİKKAT) kullanın.
Dikkat: Üretan toksik ve kanserojendir, bu nedenle her zaman maddenin üreticisi tarafından verilen güvenlik düzenlemelerine ve veri sayfasına uyun.
- % 0.9 Sodyum Klorür (NaCl) tıbbi tuzlu su çözeltisi içinde 200 mg / mL üretan çözeltisi hazırlayın.
- İntraperitoneal (IP) toplam 1.3 g / kg vücut ağırlığı üretan uygulayın. Sıçan suşuna bağlı olarak, anestezinin güvenliğini artırmak için dozu enjeksiyonlar arasında 15 dakikalık bir aralıkla iki doza bölmek mantıklı olabilir.
- Pedal çekme refleksi ve diğer uygun refleksleri kullanarak anestezi derinliğini kontrol edin. Anestezi ameliyat yapmak için yeterince derin değilse, 0.15 g / kg vücut ağırlığı üretan IP enjekte edin ve 15 dakika daha bekleyin.
- Kornea dehidrasyonunu önlemek için bir göz merhemi sürün.
- Anestezi sırasında solunum hızını ve pedal çekme refleksini sürekli izleyin. Ameliyat boyunca fizyolojik vücut sıcaklığının korunmasını sağlamak için sıcaklık kontrollü küçük bir hayvan ısıtma yastığı kullanın. Elektrofizyolojik kayıtlara başlamadan önce, elektriksel olmayan bir alternatife geçin (örn. sodyum asetat kafa pedi).
- Temiz bir cerrahi alan elde etmek için kürkü başın sırt tarafının yanında tıraş edin. Kesi yerinin çevresini uygun cerrahi dezenfektan ile dezenfekte edin. Hayvanı stereotaktik çerçeveye sabitleyin.
- Bir neşter ile kafa derisini sagital yönde 2 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Kafatası aponevrozunu hafifçe kazımak ve kafatasını dezenfekte etmek için bir neşter kullanın. Kalan dokuyu çıkarmak için %3 Hidrojen Peroksit (H2O2) içine batırılmış pamuk tomurcukları kullanın.
- Gerekirse kanamayı kontrol etmek için bir elektrokoter veya termokoter kullanın. Kafatası kemiği ve hipodermden kanamaları durdurun, eğer kanama 1-2 dakika sonra kendiliğinden durmazsa ve kafatasının görüşünü engelliyorsa.
- Kesici çubuğu, kafa düz kafatası konumuna gelene kadar ayarlayın, bu da stereotaksik referans noktaları olarak bregma ve lambda'nın aynı düzlemde olduğu anlamına gelir. Bu, yüksek cerrahi hassasiyet elde etmek için çok önemlidir. Standart bir stereotaksik sıçan hizalama aleti kullanın, belirlenen ucu mikroskobik görüş altında bregmaya kalibre edin ve alet üzerindeki bregma ve lambda için belirlenen noktalar aynı anda kafatasına değene kadar kesici çubuğu ayarlayın.
not: Bir taraftan odaklanmış ışıkla diğer taraftan bir görünüm bu durumu belirlemeye yardımcı olabilir. Alternatif olarak, ince bir kanül ile stereotaksik bir tutucu alın ve mikroskobik görüş altında Bregma ve lambda'nın dorsoventral koordinatlarını ölçün. Bregma ve lambda'nın dorsoventral koordinatları aynı olana kadar kesici çubuğu ayarlayın.
- Kanüllü bir stereotaksik tutucu kullanın, bregmaya kalibre edin ve ardından kafatasındaki tüm matkap deliklerinin konumunu hesaplayın. Stereotaksik tutucuyu kullanarak, kafatasını dikkatlice çizerek veya cerrahi bir renk işaretleyici kullanarak açılacak deliklerin konumlarını işaretleyin. Bunun için koordinatlar hedeflere bağlıdır; Serebellar referans elektrotları için önerilen koordinatlar da dahil olmak üzere Tablo 1'deki hiperdirekt yol için brekmaya referansla koordinatlar verilmiştir.
- Bir mikro matkap kullanarak tüm delikleri dikkatlice delin. Subtalamik çekirdek (STN) ve substantia nigra pars retikülat (SNr) için ortak bir delik açın (yaklaşık 2 mm x 3 mm boyutunda). Diğer tüm matkap deliklerinin çapı yaklaşık 1 mm olmalıdır.
- İki ince kanül (en az 27 G) alın ve sert bir yüzey veya cımbız kullanarak kancalı bir şekil oluşturmak için uçlarını bükün. Matkap deliklerindeki kalıntıları temizlemek için bunları kullanın ve ortak STN/SNr deliğinde dura materini dikkatlice kesin ve çıkarın.
- Matkap deliklerini fizyolojik tuzlu su ile yıkayın. Beynin ve duranın kurumasını önlemek için matkap deliklerine her 15 dakikada bir damla fizyolojik salin uygulayın.
- Bir mikro matkap ve uygun paslanmaz çelik mikro vida (örn. M 1,2 mm x 2 mm vida) alın, bir delik açın ve beyincik üzerindeki referans epidural elektrotların matkap delikleri arasına bir mikro vida vidalayın, aynısını M1 epidural elektrotlar için de yapın.
- Kendi kendine oluşturulan Ag/AgCl epidural elektrotları, referans elektrotları ve M1 elektrotları için açılan deliklere kaydırın. Elektrot ucunu ince cımbızla yönlendirin ve doğrudan kafatası kemiğinin altından matkap deliğine kaydırın.
- Tüm epidural elektrotları iki bileşenli dental akrilik ile sabitleyin. Bregma noktasını kapatmadığınızdan veya ortak STN/SNr deliğini etkilemediğinizden emin olun.
- Hazırlanan tutucuyu tungsten mikrotel elektrotlarla stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- STN'yi hedeflemesi amaçlanan en ventral elektrodu bregmaya kalibre edin. Ortak STN / SNr deliğinin üzerinde hesaplanan konuma ayarlayın ve elektrotları mikroskobik görüş altında beyne indirin. Tungsten mikrotel elektrotların beynin içine düzgün bir şekilde girdiğinden emin olun.
2. Elektrofizyolojik Haritalama ve Kayıtlar
NOT: Bu adım için, bir Faraday kafesi ve çevrimiçi filtreleme ve çevrimiçi spike sıralama yapabilen kayıt yazılımına sahip çok kanallı bir elektrofizyolojik kayıt sistemi gereklidir. Tercihen, elektriksel gürültüyü ve artefaktları mutlak minimumda tutmak için hayvanların kafasına yakın yerleştirilmiş bir ön yükseltici ile çalışan bir sistem kullanın. Tungsten mikrotel elektrotların yanı sıra, hiperdirekt yolun kayıtlarını gerçekleştirmek için en az bir epidural ve bir referans elektrot gereklidir. Epidural ve referans elektrotların birbirine değmeden ikili olarak yerleştirilmesi önerilir, bu arıza durumunda yardımcı olur ve veri analizinde farklı referans türlerine izin verir.
- Stereotaksik çerçevenin üzerine mobil bir Faraday kafesi yerleştirin. Yalnızca sabit bir Faraday kafesi mevcutsa, stereotaksik çerçeve son konumuna gelene kadar derin beyin elektrotlarının beyne indirilmediğinden emin olurken, stereotaksik çerçeveyi dikkatlice Faraday kafesine taşıyın.
- Elektrotları elektrofizyolojik kurulumun baş aşamasına bağlayın. Referans elektrotlarının uygun referans kanallarına bağlı olduğundan emin olun.
- Kayıt yazılımını ayarlayın: Bant geçiren filtre (0.05-8.000 Hz) ve ham veri sinyalini yükseltin (1.500-2.000x kazanın). Uygun ayarlara sahip çevrimiçi bir LFP ve ani artış filtresi kullanın (LFP'ler için bant geçiren filtre 0,05-250 Hz, MUA için bant geçiren filtre 300-8.000 Hz). Tüm filtreler için butterworth tipi bir filtre kullanın.
- Varsa, çevrimiçi ani artış sıralaması için bir ani artış eşiği ayarlayın. Çoğu kayıt yazılımı, üzerinde bir sinyalin yazılım tarafından ani yükselme olarak işaretlendiği bir genlik değeri olan bir ani yükselme eşiğinin ayarlanmasına izin verir. Bu eşik, filtrelenmiş spike sinyalinin ortalama genliğinin bir faktörü veya standart sapması olarak matematiksel olarak belirlenebilir veya tercihen <500 ms veri segmentlerinin görsel olarak incelenmesiyle belirlenebilir ve grafiksel bir kullanıcı arayüzünde sinyal gürültüsünün üzerinde bir çizgi olarak ayarlanabilir.
not: Bir ani yükselme eşiği oluşturmanın amacı, şu anda kaç nöronun kaydedildiği ve sivri uçlarının nasıl şekillendiği hakkında bilgi sağlamak için ani artışları saymak ve birimleri sıralamaktır.
- Tungsten mikrotel elektrotları, hiperdirekt yol için STN olan hedefin 1 mm dorsaline yavaşça indirin. Gerekirse sinyalin stabilize olmasını bekleyin.
- Elektrofizyolojik haritalama için, elektrotları ventral olarak 100 μm'lik adımlarla ilerletin. Her adımda, ateşleme düzenini, ateşleme hızını ve sivri uçların şeklini değerlendirin. Bunları Şekil 1'de verilen tipik örneklerle karşılaştırın. Yaygın olarak, yoğun çekirdekler birkaç dorsoventral basamak üzerinde hızlı ve sürekli sivrilme gösterirken, lif açısından zengin yapılar sonraki ventral adımlarda düşük ateşleme oranları ve daha az homojen başak aktivitesi gösterir.
- Hiperdirekt yol için, en ventral elektrotun STN.
içinde olduğundan emin olun.
not: Zona incerta'nın ventralinde MUA'da önemli bir artış tespit edildiğinde STN'ye ulaşılır. STN'ye ventral olarak, elektrot iç kapsüle ulaştığı için ani yükselme neredeyse tamamen durur. En ventral elektrot STN'de olduğunda, tungsten mikroelektrotların konfigürasyonu posterior, ikinci elektrotun SNr'de olmasını sağlar. STN ve SNr'de tipik MUA'yı aynı anda kaydetmek için küçük artışlarla dorsoventral ince ayar gerekli olabilir. MUA frekansının, gerçekte kaydedilen nöron sayısına ve beyin aktivasyonu seviyesine bağlı olduğunu unutmayın.
- Elektrotlar istenen yapılara geldiğinde, çevrimiçi filtrelemeyi ve ani sıralamayı ayarlayın (bkz. Şekil 2) ve ardından verilerin kaydına başlayın. LFP kayıtlarında tanımlanabilen farklı kortikal senkronizasyon durumları için tipik örnekler Şekil 3'te gösterilmektedir.
Tablo 1: Hiperdirekt kortiko-bazal gangliyon yolunun kaydı için stereotaksik koordinatlar. Tüm noktalar kafatası üzerindeki bregma referans noktasından mm cinsinden ölçülür; N.A.- Uygulanamaz.
| Bregma'dan koordinatlar | Stn | Snr | M1 Sınıfı | Referans 1 | Referans 2 |
| ön-arka | -3,6 | -4,8 | +3,0 | -10,0 | -10,0 |
| medial-lateral | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3,0 |
| dorsal-ventral | -8,0 | N. A. | N. A. | N. A. | N. A. |
