Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Deney Düzeneğinin Günlük Hazırlanması
- Amplifikatörü, bilgisayarı ve kamera sistemini açın ve yazılımın çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
- Yapay beyin omurilik sıvısını (ACSF) 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve karbojen ile köpürtün.
- ACSF'yi dolaştırmak için peristaltik bir pompa kullanın. Akış hızını yaklaşık 1 mL/dk'ya ayarlayın.
- Emme pipetinin yüksekliğini, deney odasının içindeki sıvı seviyesi her zaman sabit olacak şekilde ayarlayın.
not: Çözeltinin seviyesi, kararlı bir kayıt elde etmek için önemlidir, bu nedenle ayarlama bir mikromanipülatör kullanılarak yapılmalıdır.
- 3 M KCl agar (%2) ile doldurulmuş sarı çipten oluşan toprak elektrodunu, az miktarda 3 M KCl çözeltisi içeren bir Ag-AgCl teli ile bir tutucuya takın.
- Konik ince borulu sarı bir uç kullanarak cam elektroda (1 mm dış çap, 0,78 mm iç çap mikropipet çektirme ile çekilen) az miktarda ACSF (hacmin yaklaşık üçte ikisi) doldurun ve elektrot tutucusuna yerleştirin.
- Tutucuyu manipülatöre takılan çubuğa takın. Elektrot direncinin yaklaşık 1 MΩ.
olduğunu bir amplifikatör kullanarak emin olun.
not: Uzun şaftlı geniş açıklıklı (4-8 μm açıklıklı) yama tipi elektrot, alan kaydı için ve uyarıcı bir elektrot olarak iyi olmalıdır.
2. Bir Kayıt Oturumu Başlatma
- Forseps ile nemli odadan bir dilim hazırlığı alın.
- Dilimi mikroskop altında hızlı bir şekilde deney odasına yerleştirin (Şekil 1).
- Halkanın kenarını silikon O-ringin içine sıkıca itin. Zarı veya deney odasının altını kırmamaya dikkat edin.
not: Görüş alanındaki uyarıcı ve kayıt elektrotlarının yönüne göre dilimin yönü dikkate alınmalıdır. Sağlıklı dilim membran filtreye yapışmalıdır, bu nedenle dilimleri sabitlemek için ağırlıklar ve naylon ağlar gibi başka cihazlar kullanmaya gerek yoktur.
- Uyarıcı elektrotun ucunu ve alan potansiyeli kayıt elektrodunu, iletilen ışıkla mikroskop altındaki dilime yerleştirin.
- Yanıtı kontrol etmek için elektrofizyolojik kayıt sistemini kullanın. Verilen konfigürasyon ile olağan (lekesiz) elektrofizyolojik kaydı onaylayın.
not: Kayıt elektrodu atlanabilir, ancak dilimin fizyolojisini kontrol etmek için yararlıdır.
- Uyarma ışığı yoğunluğunu, 70x suya daldırma objektif lensi ve 80x PLAN APO tüp lensi ile 10 kHz'de örnekleme yaparken numunede 13-15 mW/cm2'ye karşılık gelen kameradaki maksimum kapasitenin yaklaşık %5-1'ine ayarlayın. Uyarma ışığı dalga boyu 530 nm'dir ve emisyon filtresi > 590 nm'dir.
not: Uyarma ışığı miktarını en aza indirmek için bir deklanşör kullanın. Sürekli ışık maruziyeti kesit fizyolojisini bozabilir. Işığın olası zararlı etkisi, ışığın yoğunluğuna ve süresine bağlıdır. Işığın etkisini değerlendirmek için elektrofizyolojik kayıt kullanın. Mukavemetin 13-15 mW/cm2 olması durumunda, yaklaşık 1 s maruziyet toleransın üst sınırı olmalıdır.
- Odak dalga boyuna bağlı olarak farklı olabileceğinden, floresan ışık kaynağını kullanarak odağı toplama sistemi ile ayarlayın ve alımı başlatın.
- Bir görüntü alma yazılımındaki verileri inceleyin.
not: Detaylı analiz için sayısal analiz yazılımının orijinal mikroprogramlama paketini kullandık.
