Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvanlar
- Jackson Laboratuvarı'nda bulunan genetik olarak tasarlanmış OR-IRES-tauGFP (OR = Koku alma reseptörü, IRES = İç ribozom giriş bölgesi, tauGFP = tau-yeşil floresan proteini) fareleri kullanın. Bu fareler, akson hedeflemesini ve koku alma sisteminin gelişimini analiz etmek için Dr. Peter Mombaerts'in laboratuvarında geliştirildi. Örneğin, stok numarası 006643 olan MOR23-IRES-tauGFP hattı, resmi suş adı B6'yı taşır; 129P2-OLFR16TM2Anne/AnneJ; benzer şekilde, 6717 stok numaralı SR1-IRES-tauGFP hattı, resmi B6 adını taşır; 129P2-OLFR124TM1Anne/AnneJ.
- Hayvanların yaşı ile ilgili olarak: protokolün daha iyi bir sonucu için, 2 ila 4 haftalık hayvanları kullanın. Bu yaş grubunda diseksiyon daha kolaydır (daha yumuşak kemikler, daha sıkı koku alma epiteli) ve dendritik topuzlar yaşlı hayvanlara göre daha büyüktür.
2. Elektrotların ve Çözeltilerin Hazırlanması
- Uyarıcı pipetler için: önceden çekilmiş uyarıcı pipetler satın alın. Aksi takdirde, bunları manuel olarak hazırlayın.
- Bir alev kullanarak, altı adet 1 mm'lik cam pipeti uçtan yaklaşık 1 cm uzakta bükün. Bu altı pipeti ve bir delikle güçlendirilmiş 1,5 cm'lik ısıyla daralan düz 7. makaronu yerleştirin.
- Isı, varilleri birbirine bağlı tutmak için boruyu küçültür. Namluların diğer ucuna ek bir ısıyla daralan makaron takın. Bu uyarıcı pipeti çok namlulu bir çektirme ile çekin.
- Bükülmüş uçları güçlendirmek için deliğin etrafına biraz beyaz sıvı yapıştırıcı ekleyin. Gece boyunca kurumaya bırakın (O/H).
- 1 veya 2 L normal Ringer'in hücre dışı çözeltisini hazırlayın (mM cinsinden: NaCl 124, KCl 3, MgS04 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glikoz 15; pH 7.6 ve 305 mOsm). Kullanana kadar 4 °C'de tutun.
- Hücre içi stok çözeltisi hazırlayın (mM cinsinden): KCl 70, KOH 53, metansülfonik asit 30, etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) 5, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) 10, sükroz 70; pH 7.2 (KOH) ve 310 mOsm. Kullanana kadar 4 °C'de tutun. Birkaç hafta boyunca iyi.
- Deneyden önce nistatin ile hücre içi kayıt solüsyonunu doğaçlama olarak (son dakikada) hazırlayın.
- 3 mg nistatin tartın, 50 μl dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin; 20 saniye girdap, ardından tamamen seyreltilene kadar 2-3 dakika sonikasyon.
- 5 ml hücre içi stok çözeltisine 20 μl DMSO-nistatin çözeltisi ekleyin. Vorteks 20 saniye, ardından 3 dakika sonikasyon. Bu çözeltiyi 4 ° C'de tutun ve doğrudan ışıktan koruyun, nistatin ışığa duyarlıdır. Bu çözelti birkaç saat boyunca kullanılabilir. Her gün değiştirin.
- Koku alma epitel hazırlığı mikroskop altına girdikten sonra, elektrotları doldurmak için bu çözeltinin bir kısmını alevle uzatılmış sarı uçlu 1 ml'lik bir şırıngada alın; doğrudan ışıktan koruyun. Oda sıcaklığında (RT) bir kez, nistatin çözeltisi stabil değildir; Çözeltiyi her saat 1 ml'lik şırıngada değiştirin veya buzda tutun.
- Dahili nistatin çözeltisi ile 15-20 MΩ dirençli uzun boyun ve küçük uç (~ 2 μm) elde etmek için kayıt elektrotlarını bir çektirme ile çekin.
- Çeker ocak altında DMSO'da 0,5 M'de koku çözeltisi hazırlayın; alikot ve kullanana kadar -20 ° C'de tutun. İstenilen konsantrasyona kadar Ringer çözeltisindeki koku maddesini seyreltin. Uyarıcı pipeti doldurun.
3. Koku Alma Epitelinin Hazırlanması
Not: OR-IRES-tauGFP fareleri, tauGFP'yi OR promotörün kontrolü altında eksprese eder. Bu farelerde, ilgilenilen ameliyathaneyi ifade eden tüm nöronlar GFP ile etiketlenir. Bu protokol, tüm bölgelerde ifade edilen ameliyathaneler için uyarlanmıştır. Bununla birlikte, dorsal bölgede eksprese edilen ameliyathaneler için diseksiyonlar ve kayıtlar daha kolaydır.
Bir - ketamin ve ksilazin karışımı (sırasıyla 150 mg / kg ve 10 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte ederek hayvanı uyuşturun. Dekapitasyon, genç fareler için keskin makaslarla veya yaşlı fareler için uygun şekilde bakımı yapılmış bir kemirgen giyotini ile yapılabilir.
- Halka diseksiyon makası kullanarak, dorsal deriden uzunlamasına medial bir kesi yapın. Cildi çekerek çıkarın. Makas kullanarak alt çeneleri çene ekleminden kesin. Dişlere paralel bir koronal kesi ile üst ön dişleri çıkarın.
- Başın gözlerin arkasında koronal bir kesim yapın ve başın sadece ön kısmını tutun. Dürbün altındaki diseksiyon için buz gibi soğuk bir Ringer solüsyonuna batırın.
- Dürbün altında diseksiyon: ventral tarafta, üst çene / dişler boyunca uzunlamasına bir kesim yapın. Burun boşluğunun dorsolateral tarafını takip ederek sırt kemiklerini uzunlamasına kesin. Çoğu kemiği ve damağı çıkarın; septumu ve ona bağlı epiteli RT'de oksijenli Ringer'a aktarın.
- Son diseksiyon için: Kayıt seansına başlamadan hemen önce, alttaki septumdaki epiteli forseps ile soyun. Yapışıklığın daha güçlü olduğu septumun ön kısmında forseps ve iki adet 4-5 mm'lik makas kesisi (mikro vannas makası kullanın) ile epitel ayırın.
- Vomeronazal organı, septal epitele olan dorsal bağlantısı boyunca keserek dikkatlice çıkarın. Epiteli, mukus tabakası yukarı bakacak şekilde bir kayıt odasına aktarın; Bir arp ile haznede düz tutun.
- Odayı, floresan optiği ve hassas bir kamera ile donatılmış dik bir mikroskop altına yerleştirin. Hazırlığı, 40X suya daldırma objektifi (sayısal diyafram açıklığı 0,8) ve büyüteçli lens tarafından elde edilen ekstra 2X veya 4X büyütme ile yüksek büyütmede bilgisayar ekranında görselleştirin. RT'de (1-2 ml / dak) oksijenli Ringer ile sürekli olarak perfüze edin.
4. Kayıt Oturumu
- Floresan hücreleri arayın: 530-550 nm aralığında ışık yayan EGFP için 480 nm'de hazırlığı uyarın; floresanda ve parlak alan altında güvenilir bir şekilde görülebilen bir dendritik düğmeyi hedefleyin.
- Elektrodu hücre içi çözelti ile nistatin ile doldurun; elektrot üzerine hafifçe vurarak kabarcıkları çıkarın.
- Elektrodu elektrot tutucusuna yerleştirin, pipete pozitif basınç uygulayın; Direnç 15-20 MΩ olmalıdır.
- Elektrodu hücreye yaklaştırın; direnç ~ 40 MΩ'a ulaştığında, pozitif basıncı serbest bırakın ve bir gigaseal ulaşmak için hafif negatif basınç uygulayın.
- Sızdırmazlığa ulaşıldığında, membran potansiyelini yaklaşık -75 mV'ye ayarlayın;
- Hücre açıldıktan sonra stimülasyon protokolleri, farmakolojik tedaviler ile devam edin. Tek bir koku verici stimülasyonuna yanıtı ölçmek için, 200-500 msn spontan aktivite kaydedin, 500 msn için uyarın ve hücrenin tepkisini 10 saniyeye kadar ölçün. Farmakolojik tedaviler için, farmakolojik ajanları istenen konsantrasyonda perfüze edin.
