Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. CMOS (tamamlayıcı metal oksit yarı iletken) kamera ile ayrı veya dallanan yama kablosu arasındaki optik yolun hizalanması
- 5 eksenli çeviricideki tüm vidaları gevşetin (Şekil 1B).
- Yama kablosunu (Şekil 1B) 5 eksenli çeviriciye takılan adaptöre [SMA (alt minyatür A) veya FC (fiber optik konektör)] vidalayın.
- 470 nm uyarma ışığını (Şekil 1B) düşük güçte (100 μW) açın ve yama kablosunun ucunu otomatik floresan plastik bir slayta bakacak şekilde yerleştirin. Bunun gelecekteki kayıtlar üzerinde herhangi bir etkisi yoktur, yalnızca hizalama sürecini görselleştirmek içindir.
- CMOS kameradan (Şekil 1B) canlı modda kayıt yapın. Görüntü tamamen siyah olmayana kadar kazancı artırın veya arama tablosunu (LUT) ayarlayın. Önemli olan, objektifin odak noktasında bir görüntüyü görebilmektir (Şekil 1B).
- 5 eksenli çeviriciyi hedefe doğru ilerletin ve 470 nm ışığın, kamerada bir görüntü çözülene kadar yama kablosunun SMA veya FC ucundaki fiber üzerinde ortalandığından emin olun.
- Görüntü ortalanana ve iyi çözümlenene kadar X ve Y eksenlerini ayarlayın.
- Yama kablosunun yüksük ucundan yayılan ışığı gözünüzde canlandırın. İzotropik bir daire olarak görünmelidir. Dallanan bir yama kablosu kullanılıyorsa, her bir yama kablosunun yüksük uçlarında yayılan ışık miktarı benzer olmalıdır. Daire izotropik değilse veya yayılan ışık eşit değilse, 5 eksenli çeviriciyi XY ekseninde ayarlayın.
>2. Ortalama floresan yoğunluğunun ölçümü için fiberlerin etrafında ROI'lerin ayarlanması
- Lifleri daha iyi görselleştirmek için tüm uyarma ışıklarını açın. Kamera kazancını, hiçbir piksel doygun olmayacak ve fiberlerin net bir görüntüsü mevcut olacak şekilde ayarlayın.
- Canlı kayıt yapın veya ön görüntü alın.
- Liflerin etrafına ROI'ler çizin ve bunları kayıtlar sırasında ortalama yoğunluk değerlerini ölçmek için saklayın (Şekil 1A).
- Birden fazla fiber kayıt için, sinyallerde bağımsızlığı test edin.
- Tüm fiberlerden canlı kayıt.
- Bir fiberi bir ışık kaynağına doğrultun ve parmağınızla hafifçe vurun. Büyük dalgalanmalar sadece bu kanalda meydana gelmelidir (kabul edilebilir sızıntı 1:1000).
- Sinyaller bağımsız değilse, daha muhafazakar ROI'leri yeniden çizin ve bağımsızlık testini tekrarlayın.
- Hangi ROI'nin hangi elyafa karşılık geldiğini etiketlemek ve takip etmek için, elyafların ucuna renkli bant veya oje uygulanabilir. İkincil bir hatırlatma olarak herhangi bir deney başlamadan önce bir fotoğraf çekin.
3. Kayıt alanının kurulumu
- Yama kablosunu sehpalar, cl kullanarak arenanın üzerine asın.amps veya tutucular.
- Hayvanın, lifin uzunluğu tarafından engellenmeden tüm arena boyunca serbestçe hareket edebildiğinden emin olun.
- Bir edimsel kutu veya açık alan kullanılıyorsa, yama kablosunun hayvana minimum bükülme ile ulaşabildiğinden emin olun. Bu bir burun dürtme gerektiriyorsa, elyafın bükülmesini önlemek için baş üstünde yeterli alan olduğundan emin olun. Yama kablosunun aşırı bükülmesini veya bükülmesini önleyin.
4. İn vivo kayıtlar
- Yama kordonunun liflerinin distal ucunu gözle ve bir minifiber mikroskobu ile görsel olarak inceleyin. Liflerin yüzeyi çizilirse, ince kumlu (1 μm ve 0,3 μm) lifleri parlatma/alıştırma filmi kullanarak lifleri yeniden parlatın.
- Yama kablosunun distal uçlarını %70 etanol ve pamuk uçlu bir aplikatör ile temizleyin.
- Fiber optik kanülleri %70 etanol ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak temizleyin.
- Yama kablosunun yüksük ucunu, siyah bir shrink makaron ile kaplanmış seramik bir bölünmüş manşon kullanarak implante edilmiş fibere bağlayın. Bağlantı sırasında manşonun sıkı olduğundan emin olun. Aksi takdirde, yeni bir kılıf kullanın.
not: Yama kordon yüksüğü ile implant arasında herhangi bir boşluk varsa, büyük miktarda sinyal kaybı olacak ve kayıtlar çalışmayacaktır.
- Davranış testinin başlamasından önce hayvanın birkaç dakika iyileşmesine izin verin.
- Optik sinyali kaydetmeye başlayın ve deneyi çalıştırın.
- Kayıt sırasında, kaliteli kayıtlar sağlamak için canlı izlemeye dikkatlice bakın. Sinyalin, kaydın ilk 2 dakikasında zamanın bir fonksiyonu olarak hızla azalması bekleniyor. Bu etki, ısı aracılı LED bozunmasından kaynaklanır, bu sayede ısıdaki artış optik elemanın direncini arttırır.
- Sinyalde GCaMP'nin açma/kapama kinetiğini aşan bir sıçrama meydana gelirse, bu genellikle manşonun yeterince sıkı olmadığını ve yama kordonu ile implant arasındaki boşluğun değiştiğini gösterir. Bu durumda, deneyi durdurun ve yeni bir kılıf kullanarak hayvanı yeniden bağlayın.
