Fare Beyin Dilimlerinde Retinogenikülat ve Kortikogenikülat Sinapsların Elektrofizyolojik Bir Çalışması

Özet

Kaynak: Chen, X., et al. Retinogenikülat ve Kortikogenikülat Sinaps Fonksiyonunun Elektrofizyolojik Araştırılması. J. Vis. Uzm. (2019).

Video, fare beyin dilimlerindeki retinogenikülat ve kortikojenikülat sinapsların elektrofizyolojik kaydını açıklar. Dorsal lateral genikülat çekirdeği (dLGN) içeren dilimler bir kayıt odasına yerleştirilir. Retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) uyarmak ve retinogenikülat sinapsları araştırmak için optik kanal üzerine veya kortikal nöronları uyarmak ve kortikogenikülat sinapsları araştırmak için nükleus reticularis talami'ye uyarıcı bir pipet yerleştirilir. Stimülasyon üzerine, RGC'ler ve kortikal nöronlar, LGN röle nöronlarında sinaptik akımlar üreten uyarıcı nörotransmiterleri serbest bırakır. Bu akımlar, yama kelepçeli bir kayıt pipeti kullanılarak kaydedilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Çözümler

1. Diseksiyon çözümü
   1. Eksitotoksisiteyi azaltmak için, burada sunulduğu gibi diseksiyon sırasında kullanılacak kolin bazlı bir çözelti hazırlayın (mM cinsinden): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 kolin klorür, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂ ve 25 glikoz. Diseksiyon solüsyonunu deneyden 1 haftadan daha kısa bir süre önce hazırlayın.
2. Kayıt çözümü
   1. 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ ve 25 glikoz içeren yapay bir beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi hazırlayın. N-metil-D-aspartat (NMDA) ve GABAA reseptörlerini bloke etmek için sırasıyla 50 μM D-2-Amino-5-fosfonovalerik asit (D-APV) ve 10 μM SR 95531 hidrobromür (gabazin) ekleyin.
3. Hücre içi çözüm
   1. (mM cinsinden) aşağıdakileri içeren hücre içi bir çözelti hazırlayın: 35 Cs-glukonat, 100 CsCl, 10 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 10 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 0.1 D-600 (metoksiverapamil hidroklorür). CsOH ile pH'ı 7.3'e ayarlayın. Stok çözeltisini süzün, çıkarın ve kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

2. Diseksiyon

1. Biri 100 mL diseksiyon solüsyonu ve diğeri 100 mL kayıt solüsyonu ile doldurulmuş iki dilim odası hazırlayın. İki kabı bir su banyosuna (37 ° C) yerleştirin ve diseksiyondan önce solüsyonları en az 15 dakika boyunca karbojen ile köpürtün.
2. Plastik bir kabı 250 mL'lik buz gibi soğuk (ancak dondurulmamış) diseksiyon solüsyonu ile doldurun. Kullanmadan en az 15 dakika önce karbojen ile köpürtün.
3. Beyin diseksiyonunun yapılacağı plastik bir Petri kabını (100 mm x 20 mm) soğuk diseksiyon solüsyonu ile doldurun. Petri kabının kapağına bir parça filtre kağıdı yerleştirin.
4. Vibratomun diseksiyon odasını soğutun.
Bir
5. fareyi% 2.5 izofluran ile, örneğin fare kafesinde uyuşturun. Fare bir kuyruk tutamına cevap vermez, fareyi servikal medullanın yakınında kesin ve kafayı Petri kabının tabanındaki buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisine daldırın.
6. Başın derisini kaudalden nazal doğru kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için parmaklarınızla yanlamasına tutun. Ön beyni çıkarmak için önce kafatasını arka-ön orta hat ile birlikte kesin ve ardından koronal sütür ve lambdoid sütürden iki kez daha kesin (Şekil 1A).
7. Koronal sütür ile lambdoid sütür arasındaki kafatasını, beyin açıkta kalacak şekilde çıkarın. Koku soğancığını kesin ve ince bir bıçakla ön beyni orta beyinden ayırın (Şekil 1B). Beyni ince bir spatula ile kafatasından çıkarın ve Petri kabının kapağındaki filtre kağıdına yerleştirin.
   not: Hücre ölümünü azaltmak için 2.6 ve 2.7 numaralı adımlar mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.
8. Beyin dilimindeki dLGN'ye duyusal ve kortikal girdilerin bütünlüğünü korumak için, iki yarım küreyi 3−5 ° 'lik bir açıyla parasagital bir kesim ile ayırın (Şekil 1C, D). İki yarım kürenin mediolateral düzlemlerini filtre kağıdına yerleştirerek kurutun ve ardından yatay düzlemden 10−25°'lik bir açıyla kesme aşamasına yapıştırın (Şekil 1E).
9. Sahneyi metal tampon tepsisinin ortasına yerleştirin ve buz gibi soğuk diseksiyon solüsyonunun geri kalanını yavaşça tampon tepsisine dökün. Güçlü bir dökme yapışan beyni çıkarabileceğinden bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin (Şekil 1F).
10. Tampon tepsisini, diseksiyon sırasında düşük sıcaklığın korunmasına yardımcı olan buz dolu tepsiye yerleştirin. Tıraş bıçağı ile 0,1 mm/sn hızında ve 1 mm genlikte 250 μm'lik dilimler kesin.
11. Dilimleri oksijenli diseksiyon solüsyonu ile doldurulmuş tutma odasında 34 °C'de yaklaşık 30 dakika tutun ve ardından dilimlerin kayıt solüsyonunda 34 °C'de 30 dakika daha toparlanmasına izin verin.
12. Geri kazanımdan sonra, dilim tutma haznesini su banyosundan çıkarın ve dilimleri deneylerde kullanılana kadar oda sıcaklığında (RT) tutun.

3. Elektrofizyoloji

1. Borosilikat cam kılcal damarlar ve bir filament çektirme kullanarak pipetleri çekin. Kayıt pipetlerinin direncini 3−4 MΩ'da tutun. Aynı protokolü kullanarak uyarıcı pipetleri çekin, ancak çapı artırmak için çektikten sonra ucu hafifçe kırın. Uyarıcı pipetleri kayıt solüsyonu ile doldururken kayıt pipetlerini hücre içi solüsyon ve biyosit ile doldurun.
2. Dilimleri kayıt odasına yerleştirin ve dilimleri RT'de oksijenli kayıt solüsyonu ile sürekli olarak perfüze edin. Tüm dilimleri kontrol edin ve sağlam bir optik kanal gösterenleri seçin.
3. Kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) video mikroskobu ile donatılmış dik bir mikroskopla dilimi ve hücreleri görselleştirin.
   not: Röle nöronları, daha büyük soma boyutları ve daha fazla primer dendrit (soma dan çıkan dallar) ile internöronlardan ayrılır. İnternöronlar, daha küçük bir soma ile bipolar morfoloji gösterir.
4. Hücreyi kayıt pipeti ile yamalamadan önce uyarıcı pipeti dilimin üzerine yerleştirin. Retinogenikülat sinapsları araştırmak için, uyarıcı pipeti doğrudan retinal ganglion hücrelerinden gelen akson liflerinin demetlendiği optik sisteme yerleştirin (Şekil 2A). Kortikogenikülat sinapsları analiz etmek için, uyarıcı elektrodu dLGN'ye rostroventral olarak bitişik olan nükleus reticularis thalami üzerine yerleştirin (Şekil 2B).
5. Kayıt pipeti kayıt çözeltisine daldırıldıktan sonra, pipet direncini izlemek için 5 mV'luk bir voltaj adımı uygulayın. Tutma potansiyelini 0 mV'a ayarlayın ve tutma akımı 0 pA olacak şekilde ofset potansiyelini iptal edin.
6. Pozitif basınç uygularken kayıt pipeti ile hücreye yaklaşın. Pipet hücre zarıyla doğrudan temas ettiğinde, pozitif basıncı serbest bırakın ve tutma potansiyelini -70 mV'a ayarlayın. Hücre zarının cam pipete yapışmasına izin vermek için hafif bir negatif basınç uygulayın, böylece bir gigaohm conta oluşur (direnç >1 GΩ). Pipet kapasitansını telafi edin ve negatif basınç darbeleri uygulayarak hücreyi açın.
7. Sinaptik fonksiyonu araştırmak için, stimülasyon pipeti aracılığıyla 0,1 ms akım darbeleri (yaklaşık 30 μA) uygulayın. Sinaptik yanıt gözlenmezse, uyarıcı pipetlerin değiştirilmesi gerekebilir. Uyarıcı pipetleri yerleştirirken, kaydedilen hücrenin kaybolmaması için dikkatli olun.
   not: Şekil 2'de gösterilen örnek kayıtlarda, optik trakt veya kortikogenikülat liflerin 30 ms ara uyaran aralıkları ile iki kez uyarılmasıyla sinaptik kısa süreli plastisite araştırılmıştır. Eşleştirilmiş darbe oranı (PPR), ikinci uyarıcı postsinaptik akımın (EPSC) genliğinin birinci EPSC'ninkine (EPSC2 / EPSC1) bölünmesiyle hesaplandı. Her stimülasyon protokolü 20 kez tekrarlandı. EPSC genliği, 20 taramanın ortalama akımlarından ölçüldü. Tekrarların neden olduğu kısa süreli plastisiteyi önlemek için her tekrar arasındaki zaman aralığı en az 5 sn idi.
8. 5 mV'luk bir voltaj adımı uygulayarak seri direnci sürekli olarak izleyin. Analiz için yalnızca seri direnci 20 MΩ'dan küçük olan hücreleri kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1: Diseksiyon protokolünü temsil eden şemalar. (A) İlk kesimlerin konumunu gösteren fare kafatasının yatay görünümü. İlk kesi sagital sütür ile birlikte yapıldı, ardından sırasıyla koronal sütür ve lambdoid sütür ile birlikte iki kesi daha yapıldı. Kesikli çizgiler kesileri temsil eder. (B) Tüm beynin sagital görünümü. Kesikli çizgiler, beynin koku soğancığı ve ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
yükselteç	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Çift yama kelepçesi amplifikatör
CaCl2	EMSURE (EMIN OLUN	1.02382.1000
kolin klorür	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu	Leica Mikro Sistemler	TCS SP5
CsCl (İngilizce	EMSURE (EMIN OLUN	1.02038.0100
Cs-glukonat	Kendi kendine hazırlanmış		Ticari bir Cs-glukonat olmadığı için kendimiz hazırladık
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG
D-APV	Biyotrend	BN0085-100
Mikroskop O için dijital kamera	Olympus	XM10
EGTA (EGTA)	SERVA	11290,02
glikoz	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Roth	9105.2
Yüksek Akım Uyaran İzolatörü	Dünya Hassas Aletler	A385
Kartal	EMSURE (EMIN OLUN	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE (EMIN OLUN	1.05833.0250
Mikromanipülatörler	Luigs ve Neumann	SM7
Mikrop	Olympus	BX51
Montaj ortamı	ThermoFisher Bilimsel	P36930 Serisi
NaCl (Doğal)	Roth	3957.1
NaH2PO4	EMSURE (EMIN OLUN	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE (EMIN OLUN	1.06329.1000
Pipet	Hilgenberg Belediyesi	1807502
Çektirme	Sutter	P-1000
tıraş bıçağı	Kişilik	60-0138
Yarı Otomatik Vibratom	Leica Biyosistem	VT1200S
SR 95531 hidrobromür	Biyotrend	AOB5680-10	GABAA reseptör antagonisti