Bir Sıçan Beynine Kablosuz Çift Yönlü Mikroelektrot Sistemi Yerleştirilmesi

Abstract

Kaynak: Melo-Thomas, L., et al., Serbestçe Davranan Sıçanlarda Nöral Aktivitenin İn Vivo Kaydı ve Uyarılması için Kablosuz, Çift Yönlü Bir Arayüz. J. Vis. Uzm. (2017)

Video, çok kanallı sinir ağlarını kaydetmek ve uyarmak için bir sıçan beynine kablosuz çift yönlü çok kanallı bir elektrot ünitesi implante etme prosedürünü göstermektedir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Hayvanlar

1. Erkek yetişkin Wistar sıçanlarını (200-250 g) standart laboratuvar koşullarında 3-4'lü gruplar halinde, iklimlendirmeye izin vermek için ameliyattan en az bir hafta önce ev sahipliği yapın.
2. Ameliyattan iki gün sonra, çiftler halinde ev fareleri. Tek kafesleri yüksek akrilik kapaklarla örtün. Metal ızgaradan yapılmış geleneksel kapaklardan kaçının, çünkü implantlar sıkışabilir ve zamanla hasar görme ve/veya kararsız hale gelme riskini artırabilir.

2. Stereotaktik cerrahi

1. Ameliyata başlamadan önce aşağıdaki ekipman ve malzemeleri düzenleyin ve hazırlayın:
   1. Steril makas, künt uçlu forseps, spatula, cerrahi makas, diş matkabı ve pamuklu çubuklardan oluşan steril cerrahi ekipman edinin.
   2. İzofluran, ksilokain, tramadol hidroklorür, dexpantenol göz merhemi, %3 hidrojen peroksit, povidon iyot ve %70 etanol dahil olmak üzere ilaçlar ve kimyasallar elde edin.
   3. Paslanmaz çelik vidalar, akrilik reçine, ultraviyole yapıştırıcı ve kapak koruyucu dahil olmak üzere sabitleme malzemesi elde edin.
   4. (i) bir kayıt tek elektrotundan (kuvars cam yalıtımlı platin tungsten mikroelektrot, konik uç şekli, dış çap: 80 μm, konik uç, 1 kHz'de empedans: 500 kOhm) veya bir tetroddan (kuvars cam yalıtımlı platin/tungsten 4 çekirdekli mikroelektrot, dış çap: 100 μm, konik uç, 1 kHz'de empedans) oluşan bir mikroelektrot ünitesi edinin: 500-800 kOhm); (ii) bir kontak plakasına bağlı bir stimülasyon elektrodu (platin/iridyum tel (%90 platin, %10 iridyum), çekirdek çapı 125μm, dış çap 150 μm, empedans <10 kOhm) ve (iii) bir platin tel referans elektrodu (şaft çapı, 100 μm; Şekil 1A).
   5. Mikroelektrot ünitesine suda çözünür yapıştırıcı ile yapıştırılmış bir elektrot tutucu edinin ve işlevselliği en az 2 saat önceden test edin (Şekil 1B).
   6. Kayıtlar için bir diferansiyel ön amplifikatör, bir ana amplifikatör ve bir bant geçiren filtre amplifikatöründen oluşan geleneksel bir bağlı sistem edinin.
   7. Eldiven, ısıtma yastığı, şırınga ve fizyolojik tuzlu su gibi ek malzemeler edinin.
   8. Ev kafesleri edinin (U x G x Y: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Prosedür
   NOT: Elektrot implantasyonu, izofluran anestezisi altında geleneksel bir stereotaktik cerrahi sırasında gerçekleştirilir.
   1. Deneyi yapan kişinin eldiven, cerrahi maske ve laboratuvar önlüğü giydiğinden emin olun.
   2. Hayvanı bir indüksiyon odasına yerleştirerek anesteziyi başlatın (izofluran% 4-5, oksijen akışı 1 L / dak, süre ~ 5 dakika).
   3. Derin anesteziyi doğrulamak için forseps ile refleks kaybını (kuyruk ve ayak refleksleri) test edin.
   4. Hayvanın kafasını stereotaktik çerçevenin üst kesici çubuğunun etrafına sabitlenmiş bir anestezi maskesine yerleştirin ve anesteziyi ayarlayın (izofluran% 2-3, oksijen akışı 0.7-0.8 L / dak).
   5. Kulak çubukları ve üst kesici çubuk kullanarak hayvanın kafasını stereotaktik aparatta sabitleyin ve yatay olarak hizalayın.
   6. Cerrahi makas veya makas kullanarak cerrahi alanı tıraş edin ve povidon-iyot ile sterilize edin.
   7. Hipotermiyi önlemek için hayvanı bir ısıtma yastığına yerleştirin ve kurumasını önlemek için gözlere dekspantenol göz merhemi uygulayın.
   8. Cerrahi alanın merkezine ksilokain (0.3-0.4 mL, deri altı, sc) enjekte edin.
   9. Refleks kaybını tekrar test edin.
   10. Kafatasını ortaya çıkarmak için cerrahi alanın ortasında bir neşter ile küçük bir kesi (1,5 cm) yapın. Cildi nazikçe ayırın ve forseps, makas ve bir spatula kullanarak kalan dokuyu çıkarın.
   11. Hidrojen peroksit kaplı pamuklu çubuklar kullanarak kafatasını dikkatlice temizleyin.
   12. Paslanmaz çelik vidaların sabitlenmesi için kafatasına 4-5 küçük delik (4,7 mm) açın.
   13. Mikroelektrot ünitesini/elektrot tutucuyu ön amplifikatöre bağlayın ve stereotaktik mikromanipülatöre takın (Şekil 1B ve 1C).
   14. Kullanılan hayvana göre bir beyin atlasından alınan koordinatları kullanarak hedef alanın üzerindeki kafatasında bir delik (yaklaşık 7 mm) açın. Bu çalışmada, aşağıdaki koordinatları kullanarak inferior kollikulusa yönelik elektrot uçlarını konumlandırın, bregma referans olarak hizmet eder: ön/arka, -8.8 mm; medial/lateral, 1.5 mm; ve dorsal / ventral, 3,5 mm.
   15. Pamuk tomurcukları ile herhangi bir kanı emdirin.
   16. Elektrot uçları hedef alana ulaşana kadar mikroelektrot ünitesini dikey olarak yerleştirin.
   17. Topraklama kablosunu paslanmaz çelik vidalar boyunca ve derinin altına yerleştirin.
   18. Spike aktivitesini izleyin ve hedef yapıdaki aktif nöronlardan oluşan bir bölgeye ulaşana kadar mikromanipülatör ile elektrot konumunu dikkatlice ayarlayın ve spike sıralama için uygun bir sinyal-gürültü oranıyla nöral aktiviteyi tespit edin.
   19. Mikroelektrot ünitesini ultraviyole yapıştırıcı ile kafatasına sabitleyin ve temas plakasını ve vidaları akrilik reçine ile kapatın.
   20. Dehidrasyonu önlemek ve postoperatif analjeziyi sağlamak için sırasıyla fizyolojik salin (1 mL ip) ve tramadol (25 mg / kg, sc) enjekte edin.
   21. Suya batırılmış bir fırça kullanarak mikroelektrot ünitesini elektrot tutucusundan ayırın.
   22. Anesteziyi durdurun ve fareyi stereotaktik çerçeveden dikkatlice çıkarın. Önünü ayırınampmikroelektrot ünitesinden.
   23. Kapak korumasını implante edilen mikroelektrot ünitesine bağlayın ve sadece deneysel prosedürler sırasında bağlantısını kesin.

Results

Şekil 1: TWS mikroelektrot ünitesi. (1) kayıt tek elektrot / tetrode, (2) stimülasyon elektrodu, (3) elektrot fiber bağlantı kartı, (4) esnek bağlantı kabloları, (5) topraklama kablosu, (6) konektör kartı, (7) TWS sistemi için erkek veya dişi konektör (A); Ön amplifikatöre (8) ve tutucuya (9) bağlı TWS mikroelektrot ünitesi; (B) stereotaksik bir çerçeveye (C

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thomas Kablosuz Sistemi (TWS) sürüm 2.0	Thomas KAYIT GmbH	AN001165	Thomas Kablosuz Sistem (TWS) sürüm 2.0, dizüstü bilgisayar, önceden yüklenmiş bir Microsoft Windows işletim sistemi ve TWS kontrol yazılımı içeren taşınabilir çok kanallı bir telemetri sistemidir. TWS şunları içerir: sabit bant genişliğine sahip düşük gürültülü 4 kanallı ön ve programlanabilir ana amplifikatör, bifazik akım darbelerinin uygulanması için tek kanallı sabit akım stimülatörü, yazılımla programlanabilir mikro stimülatör, implante edilebilir konektör sistemi ve bir hayvana montaj için temel bir kafa aşaması ünitesi. Sistem, dizüstü bilgisayarlar veya masaüstü kişisel bilgisayarlar için USB bağlantı noktası bağlantılı bir alıcı-verici, Microsoft işletim sistemi Windows altında çalışan kontrol yazılımı ile birlikte teslim edilir. TWS sistemi, hücre dışı nöral stimülasyon ve serbestçe davranan küçük hayvanlarda (örn. sıçanlar, kobaylar) kayıt için kullanılabilir. Bu sistem, daha büyük hayvanlarda (örneğin primatlar) da kullanılmak üzere uyarlanabilir.
Thomas Kablosuz Sistem (TWS) için Yazılım	Thomas KAYIT GmbH	AN001165 dahil	Thomas kablosuz sisteminin yazılımı, Microsoft Windows işletim sistemi altında çalışır ve Thomas Kablosuz Sistemi (TWS) için grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sağlar. TWS GUI, TWS işlevleri, 4 kanal kayıt ve 1 kanal stimülasyonu üzerinde tam kontrol sunar.
Kayıt (4 kanal) ve stimülasyon (tek kanal) için implante edilebilir tetrode	Thomas KAYIT GmbH	AN001132	Thomas Wireless Systems (TWS) ile kullanım için kayıt (4 kanal) ve stimülasyon (tek kanal) için implante edilebilir tetrode. Tetrode özelliklerinin kaydedilmesi: tetrode elyaf malzemesi: kuvars cam yalıtımlı platin tungsten elyaf, tetrode elyaf dış çapı: 100μm, uç şekli D, empedans 0.5-0.8MOHm; Referans elektrodu: uç şekli: D; Empedans: 300-500kOhm; Malzeme: kuvarscam yalıtımlı platin / tungsten; Stimülasyon elektrot özellikleri: fiber malzeme: platin / iridyum, çap: 125μm, lake yalıtımlı, uç şekli: D, empedans: < 10kOhm, elektrotun boyutları son kullanıcı tarafından belirlenebilir
Kayıt (tek kanal) ve stimülasyon (tek kanal) için implante edilebilir mikroelektrot	Thomas KAYIT GmbH	AN001118	Thomas Wireless Systems (TWS) ile kullanım için kayıt (tek kanal) ve stimülasyon (tek kanal) için implante edilebilir mikroelektrot. Kayıt elektrot özellikleri: elektrot elyaf malzemesi: kuvars cam yalıtımlı platin tungsten elyaf, elektrot elyaf dış çapı: 80μm / 250μm (lütfen belirtin), uç şekli D, empedans 0.5-0.8MOHm; Referans elektrodu: uç şekli: D; Empedans. 300-500kOhm; Malzeme: kuvarscam yalıtımlı platin / tungsten; Stimülasyon elektrot özellikleri: fiber malzeme: platin / iridyum, çap: 125μm, lake yalıtımlı, uç şekli: D, empedans: < 10kOhm
Elektrot implantasyonu için tutucu	Thomas KAYIT GmbH	AN000838	Standart elektrot tutucular için mikroelektrot implantasyonu için özel bükülmüş metal çubuk. Çubuk, implante edilebilir bir elektrotu tutmak için kullanılır. İmplante edilebilir elektrot, özel Thomas RECORDING suda çözünür yapıştırıcı (AN001080) ile çubuğa sabitlenir. (Elektrot tutucu dahil değildir)
Thomas Kablosuz Sistemi için yedek akümülatör güç kaynağı (3,7V/230mAh)	Thomas KAYIT GmbH	AN001208	Thomas Kablosuz Sistemi için yaklaşık 1 saatlik çalışma süresi için 230mA kapasiteli yedek şarj edilebilir pil (akümülatör). (Boyut: 27mm x 20mm x 6mm, ağırlık yaklaşık 6g)
Thomas Kablosuz Sistemi için yedek akümülatör güç kaynağı (3,7V/450mAh)	Thomas KAYIT GmbH	AN001209	Thomas Kablosuz Sistemi için 1 saatten fazla çalışma süresi için 450mA kapasiteli yedek şarj edilebilir pil (akümülatör). (Boyut: 48mm x 30mm x 4mm, ağırlık yaklaşık 11g)
Thomas Kablosuz Sistem (TWS) şarj edilebilir akümülatör için akümülatör şarj cihazı	Thomas KAYIT GmbH	AN001207	Thomas Wirless System (TWS) şarj edilebilir akümülatörler (AN001209 ve AN001209) için şebekeden güç alan şarj cihazı
Suda çözünür tutkal	Thomas KAYIT GmbH	AN001080	Thomas RECORDING suda çözünür elektrot yapıştırıcısı, nörobilimsel araştırmalarda implante edilebilir mikroelektrotlarla kullanılmak üzere özel olarak seçilmiş bir üründür. Eşsiz özellikleri, elektrot ve montaj cihazı arasında sağlam bir bağlantı sağlar, ancak ılık su ile kolayca çıkarılabilir. Thomas RECORDING suda çözünür elektrot yapıştırıcısı, zaman alıcı bir hazırlık gerektirmeden kutudan çıkar çıkmaz kullanılabilir. Thomas RECORDING suda çözünür elektrot yapıştırıcısı insanlara, hayvanlara veya çevreye zararlı değildir. Miktar: 1 kutu 10 gram
Minyatür diferansiyel ön yükseltici	Thomas KAYIT GmbH	AN000329	Minyatür Diferansiyel Ön Amplifikatör, Model MDPA-2, uyarılabilir dokudan düşük gürültülü kayıtlar için tasarlanmış 2 kanallı, diferansiyel girişli bir ön amplifikatördür. Thomas Kablosuz Sistemi (TWS) ile serbestçe hareket eden hayvan uygulamaları için implante edilebilir mikroelektrotların implantasyonu ile birlikte hücre dışı kayıt için tasarlanmıştır. 2 Kanallı Minyatür Diferansiyel Ön Yükseltici (MDPA-2), ilk on kat amplifikasyon aşamasını sağlamak için implante edilebilir mikroelektrotlara bağlanır. İdeal olarak, yüksek sinyal genlikleri ve düşük gürültü seviyeleri ile optimum kayıt sonuçları elde etmek için Thomas RECORDING kuvars cam yalıtımlı platin/tungsten elektrotlar kullanılır. MDPA-2, ek ortak topraklama ve referans elektrot girişlerine sahiptir.
Bağlantı kablosu	Thomas KAYIT GmbH	AN000330	Thomas Minyatür diferansiyel önünü bağlamak için bağlantı kablosuamplifier (MDPA-2) bir ana amplifikatöre ve bir akümülatör güç kaynağına.
Minyatür ön amplifikatör için şarj edilebilir güç kaynağı	Thomas KAYIT GmbH	AN000328	Minyatür diferansiyel ön için şarj edilebilir akümülatör güç kaynağıamplifier (MDPA-2).
Akümülatör şarj cihazı (ABD)	Thomas KAYIT GmbH	AN000167	Güç kaynağı için akümülatör şarj cihazı AN000328 (ABD şebeke elektrik prizi konektörü)
Akümülatör şarj cihazı (AB)	Thomas KAYIT GmbH	AN000168	Güç kaynağı için akümülatör şarj cihazı AN000328 (AB şebeke elektrik prizi konektörü)
Diferansiyel ön amplifikatör/ana amplifikatör/bant geçiren filtre	Thomas KAYIT GmbH	AN000677	TREC AC Ana Amplifikatör (LabAmp-03), nörofizyolojik uygulamalar (örn. mikroelektrotlarla hücre dışı kayıt) için tek kanallı, diferansiyel bir ana amplifikatördür. Bu Enstrüman, minyatür Diferansiyel Ön ile çalışmak üzere tasarlanmıştır. LabAmp-03'ün tek kanalı, yüksek kazançlı, düşük gürültülü bir diferansiyel amplifikatör aşaması ve ardından düşük frekanslı ve yüksek frekanslı filtreler içerir. Amplifikatörün iki farklı filtre amplifikatörü, bir tek birim aktivite (SUA) filtre –amplifikatörü ve bir yerel alan potansiyeli (LFP) filtre amplifikatörü vardır, her ikisi de sinyal yoluna paralel bağlanır. Kayıt Modu, ilk aşamada iki seviye sinyal kazancı (x10, x100) ve son amplifikatör aşamasında 4 ek seviye (x5, x10, x25 ve x50) sunar. Her amplifikatör, tek birim aktivitesi (SUA) 500Hz...20kHz ve yerel alan potansiyelleri (LFP) 0,1Hz...140Hz için farklı bant geçiren özelliklere sahiptir. Cihaza bir ses monitörü ve bir pencere ayırıcı entegre edilmiştir. LabAmp-03, hoparlörlü entegre bir ses monitörüne sahiptir. Bu ünite, elektrofizyolojik sinyallerin ses reprodüksiyonunu sağlar. Ünite, bir ses amplifikatörünü kompakt, sağlam bir pakette birleştirir. Bu özellikle nöral ateşlemeyi ve kas kasılmalarını izlemek için uygundur. Ses monitörü girişi dahili olarak SUA-Filter amplifikatör çıkışına bağlıdır. LabAmp-03, 100-240V AC/50-60Hz şebeke gücü çalışma voltajı aralığı için harici güç kaynağı ile birlikte teslim edilir.
USB Osiloskop	Thomas KAYIT GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Bu 2 kanallı PC osiloskopu, bir dizüstü bilgisayarda mobil kullanım ve kontrol kabinlerinde, endüstriyel ekipmanlarda ve küçük, hafif ve güçlü bir osiloskopun gerekli olduğu diğer birçok uygulamada kalıcı kurulum için mükemmeldir. Bu osiloskop, Thomas Kablosuz Sistemi (TWS) için implante edilebilir mikroelektrotların açıklanması sırasında kaydedilen hücre dışı aktivitenin görüntülenmesi için ana amplifikatörün sinyal çıkışına bağlanır. Kullanıcı, ölçüm verilerini, PC yazılımı içeren bir PC ile doğrudan PC'deki çeşitli veri arayüzleri üzerinden alabilir.
Uyarıcı üreteci	Çok Kanallı Sistemler	STG3008-FA	Akım için Uyaran Jeneratörü (STG) ve Voltaj Tahrikli Stimülasyon üç işlevi yerine getirir: akım tahrikli stimülasyon, voltaj tahrikli stimülasyon, kontrol ve zamanlama. STG, 2, 4 veya 8 bağımsız çıkış kanalıyla mevcuttur. Her çıkış kanalı için entegre izolasyon ünitelerine sahip olan STG, herhangi bir isteğe bağlı dalga formu sağlayabilir.
Elektrot için kapak koruyucusu	Thomas KAYIT GmbH	AN001193	Thomas Kablosuz Sistemi için implante edilebilir elektrot ünitesi için koruyucu kapak
Cerrahi malzeme			Makas, künt uçlu forseps, spatula, cerrahi makas, diş matkabı ve pamuklu çubuklar
İlaçlar ve kimyasallar			İzofluran, ksilokain, tramadol hidroklorür (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Almanya), dexpantenol göz merhemi (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Almanya), %3 hidrojen peroksit, povidon-İyot (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Almanya) ve %70 etanol;
Dahil olmak üzere sabitleme malzemesi			Paslanmaz çelik vidalar (BN650 M1.2x5; 4.7 mm), akrilik reçine (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Almanya), ultraviyole yapıştırıcı (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Almanya) ve kapak koruyucu (Thomas Recording GmbH, Giessen, Almanya);
İlave malzeme			Eldivenler, ısıtma yastığı, şırıngalar ve fizyolojik tuzlu su.
Küçük Hayvan Stereotaksik Aleti (SASI)	Thomas KAYIT GmbH	AN000287	Araştırmada kullanılan hayvana (sıçan, kobay, maymun vb.) göre model seçilmelidir
Video kamera	EverFocus (Sonsuza Odaklanma)		EverFocus, modeli: EQ150