$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Akut kesit kayıtları için çözümler
- Elektrofizyoloji deneylerinden önce saf deiyonize suda 10x yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) çözeltisinin (124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 ve 11 mM D-glikoz) stok çözeltilerini hazırlayın. Çözeltiyi CaCl2 ve MgCl2 içermeyen 1 L'lik şişede 4 ° C'de saklayın.
- Potasyum-glukonat bazlı pipet çözeltisini 135 mM K-glukonat, 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mM MgATP, 0.4 mM Tris-GTP, 10 mM Na 2-fosfokreatin ve post-hoc hücre morfolojisi ifşası için 2.7-7.1 mM biyositin içerecek şekilde hazırlayın. Çözeltinin pH'ını 7.3'e ve ozmolaritesini 290 mOsm'ye ayarlayın. 1 mL alikotları -20 °C'de saklayın.
2. Tüm hücre yama kelepçesi kaydı
- Hipokampal kompleksi içeren bir beyin dilimini, özel yapım bir cam transfer pipeti ile dik bir mikroskop üzerine monte edilmiş kayıt odasına nazikçe aktarın. Bir transfer pipeti, bir kauçuk pipet ampulüne bağlı kısaltılmış bir Pasteur pipetinden (iç çap 6,5 mm) yapılır. Kayıt odasını (3 mL) %34/%95 O5/CO2 ile köpürtülmüş aCSF ile sürekli olarak perfüze edin. Peristaltik pompanın hızını 2-3 mL/dk'ya ayarlayın.
- Mavi LED aydınlatmalı (470 nm) ilgili bölgedeki akson terminallerinde Chronos-GFP ekspresyonunu kısaca inceleyin ve 4x objektif ile gözlemleyin. GFP floresansı, uygun bir emisyon filtresi aracılığıyla görselleştirilir ve bir bilgisayar ekranında görüntülenen bir CCD kamera görüntüsü vardır.
- Dilimi korumak için dilimin üzerine sıkıca aralıklı naylon ipler ("arp") ile U şeklinde bir platin telden yapılmış bir dilim ankraj yerleştirin.
- 63x daldırma hedefine geçin ve odağı ayarlayın. Chronos-GFP'yi ifade eden aksonları kontrol edin ve yama kaydı için piramidal bir nöron seçin.
- Hedefi yukarı doğru hareket ettirin.
- Borosilikat camdan Kahverengi Alevli elektrot çektirme kullanarak pipetleri çekin. Çektirme, uç çapı yaklaşık 1 μm olan pipetler üretecek şekilde ayarlanmıştır. Pipetleri K-glukonat bazlı dahili solüsyonla doldurun.
- Pipeti baş bölümündeki pipet tutucusuna monte edin. Pipeti hazneye indirin ve objektifin altındaki ucu bulun. Pipet direnci 3–8 MΩ arasında olmalıdır. Pipetten bir çözelti konisinin dışarı çıktığını görmek için bir şırınga ile hafif bir pozitif basınç uygulayın ve pipeti ve hedefi kademeli olarak dilimin yüzeyine indirin.
- Hücreyi voltaj kelepçesi konfigürasyonunda yamalayın: tanımlanan nörona yaklaşın ve pipet ucunu nazikçe soma üzerine bastırın. Pozitif basınç, zar yüzeyinde bir çukur oluşturmalıdır. Giga-ohm'luk bir conta (>1 GΩ direnç) oluşturmak için basıncı serbest bırakın. Mühürlendikten sonra, tutma voltajını -65 mV'ye ayarlayın. Membranı keskin bir negatif basınç darbesiyle kırın: bu, pipet tutucusuna bağlı bir tüpe güçlü bir emme uygulanarak elde edilir.
- Tüm hücre akım kelepçesi modunda, nöronun hiperpolarize edici ve depolarize edici akım adımlarına verdiği tepkileri kaydedin (Şekil 1A).
not: Bu protokol, hücrenin aktif ve pasif içsel özelliklerini belirlemek için kullanılacaktır. Çevrimdışı analiz için özel olarak yazılmış MATLAB rutinleri kullanılır.
- Chronos'u ifade eden afferent fiberlerin tüm alan 475 nm LED stimülasyonuna akım veya voltaj kelepçesi postsinaptik yanıtlarında kayıt yapın. 20 Hz'de 2 ms süreli 10 stimülasyonlu trenlerle uyarın (Şekil 1 B, C). Işık yoğunluğu 0,1–2 mW.
arasında değişebilir
not: Işık yoğunluğu, objektifin altına yerleştirilmiş bir fotodiyot sensörü ile donatılmış bir dijital el tipi optik güç konsolu ile ölçüldü. 2-4 ms'lik yanıt gecikmeleri, monosinaptik bir bağlantı için karakteristiktir.
