Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
>1. Çok kanallı kayıtlar için donanım ve yazılım hazırlanması
- Üretici talimatlarına göre 16 kanallı bir veri toplama sistemi kurun.
not: Çok kanallı kayıtları toplamak için piyasada bulunan birkaç amplifikatör ve veri toplama sistemi kullanılabilir. Burada açıklanan deneylerde, analog sinyaller bir elektrot referans paneli aracılığıyla iki amplifikatöre iletilir, burada yükseltilir (2000x) ve filtrelenir (0.1-10kHz). Veri toplama sistemine yapılan analog girişler 40kHz'de sayısallaştırılır.
- Uygun 16 kanallı kafa aşaması adaptörünü bir mikroskop mikromanipülatörüne sabitleyin. Adaptörü, dişi konektör bağlantı noktaları aşağı bakacak şekilde yönlendirin.
- Bu mikromanipülatörün çalışma açısını, yataya göre yaklaşık 70°'lik bir açıyla kayıt odasına doğru aşağı doğru yönlendirilecek şekilde ayarlayın.
- Mikromanipülatöre bağlı kafa aşaması adaptörü aracılığıyla in vitro elektrofizyoloji için baş aşaması girişini 16 x 1 proba bağlayın.
- Kafa aşaması çıkış konektörünü veri toplama sistemine bağlayın.
- Veri toplama için uygun yazılımı yükleyin. 15 giriş kanalını, ilk 15 çok kanallı prob kontağından gelen giriş sinyallerine karşılık gelecek şekilde yapılandırın. Kalan kanalı hücre içi elektrottan giriş alacak şekilde yapılandırın.
not: Verileri toplarken ve analiz ederken, uygun sinyalin toplandığı elektrot temasına karşılık geldiğinden emin olmak için elektrot ve adaptör haritalarını dikkate almaya özen gösterin.
2. Işık stimülasyon protokollerinin yapılandırılması
- Hafif bir dağıtım sistemi kurun ve beraberindeki yazılımı yükleyin.
- Yazılımı açın. Bir Tetik Kaynağının (Dijital/TTL (Transistör-transistör mantığı) Çıkışı) ışık dağıtım sistemine bir Tetik Girişi sinyali sağladığı ve ışık dağıtım sisteminin 470 nm LED'e (ışık yayan diyot) bir Tetik Çıkışı sinyali sağladığı bir donanım kablolama konfigürasyonu seçin.
- Yüksek güçlü objektif lensi monte edin. Bir dijital kamera kullanarak, ışık dağıtım sistemi ile yüksek güçlü hedefleri kalibre edin.
- Işık stimülasyon profillerinden oluşan yeni bir profil dizisi oluşturun.
- Tercih edilen bir desen oluşturun. Burada açıklanan deneylerde, 150 μm çapında bir daire, akson terminallerinin katmana özgü aktivasyonuna izin verir.
- Bir profil dizisi oluşturmak için, herhangi bir sayıda denemenin her biri için bu profili kopyalayıp yapıştırın.
- Herhangi bir ışık yoğunluğunun, darbe süresinin veya darbe sayısının dalga biçimlerini içeren bir dalga biçimi listesi oluşturun.
- Her profile rastgele dalga formları atayın. Atanmış dalga formuna sahip her profil, bir Dijital TTL girişinden veya bir denemeden gelen bir tetikleme darbesine karşılık gelir.
- Profil sırasını kaydedin.
- Veri toplama yazılımında yeni bir protokol oluşturun.
- Deneme sayısını, oluşturulan profil dizisindeki profil sayısına eşit olacak şekilde ayarlayın.
- Adım 1.6'da yapılandırılanlarla eşleşen sinyal girişlerini seçin. Dijital tetiklemeden önce ve sonra uygun bir süre boyunca bu 16 giriş kanalından kayıt yaparak tek bir dijital TTL çıkışı sağlayan bir protokol yapılandırın.
3. Çok kanallı probun ex vivo beyin dokusu dilimine yerleştirilmesi
- Perfuse kabarcıklı eACSF (Deneysel Yapay beyin omurilik sıvısı) (kapalı torbalarda değil) 3-6 mL / dk'da.
- Bir ilgi alanı içeren beyin dilimini bir mikroskop perfüzyon odasındaki ağ ızgarasına aktarın. Platin arp ile çapa
- Ağ ızgarasını, çok kanallı probun distal ucundaki elektrot temas hattı, piyal yüzeye yaklaşık olarak dik olacak şekilde döndürün.
- Çok kanallı probu, geniş alan aydınlatması ve mikromanipülatörün hassas kontrolü altında dilimin yüzeyine doğru indirin.
- Kortikal afferentlerin akson terminallerinde eksprese edilen floresan raportör proteinini görselleştirmek için uygun filtre küpünü devreye sokmak için filtre küpü taretini döndürün. Gerekirse, probu piyal yüzeyle daha hassas bir şekilde hizalamak için dilimi döndürün.
- Probu, dilim düzleminin hemen üzerine, x ekseni boyunca nihai hedef konumdan ~200 μm kısa olacak şekilde yerleştirin ve kaydedilen doku alanının sınırının dışında en az bir kanal bırakın.
- Manipülatörü uzunlamasına ekseni boyunca hareket ettirerek probu yavaşça dilime yerleştirin. Dokuya verilen hasarı en aza indirmek için, probu yalnızca keskin uçlar doku yüzeyinin hemen altında görülebilecek kadar ilerletin. Bu, elektrot temaslarının doku ile temas halinde olmasını sağlarken dokuya verilen hasarı en aza indirecektir.
4. Hedeflenen nöronları yamalayın ve tüm hücre konfigürasyonunu elde edin
- eACSF kaynağını torbalı Kontrol çözümüne geçirin.
- Hedeflenen yama kelepçesi kaydı için floresan etiketli hücreleri tanımlayın.
- Diyafram iris diyaframını en küçük çapla sınırlayın. Düşük güçlü bir objektif lensi takın ve dokuyu netleştirin.
- Işığı, çok kanallı proba bitişik (ancak örtüşmeyen) bir doku alanı üzerinde ortalayın.
- Çok kanallı prob ile objektif lensi arasındaki teması önlemek için dikkatli olarak yüksek güçlü (40x veya 60x) suya daldırma objektifini devreye sokun.
- Cre'ye bağımlı floresan işaretleyici ifade eden hücrelerin görüntülenmesine izin vermek için uygun filtre setini devreye sokmak için filtre küpü taretini döndürün.
- Floresan etiketli bir hücreyi yama kelepçesi kaydı için hedef olarak tanımlayın. Bir yama pipetini indirmek için yeterli alan yaratmak için objektif lensi kaldırın.
- Dahili solüsyonla (Tablo 1) bir yama pipeti (bkz. Tablo 2) yükleyin ve pipeti elektrot tutucusuna monte edin. 1 mL şırınga kullanarak ~ 0.1 mL havaya karşılık gelen pozitif basınç uygulayın.
- Yama pipetini çözeltiye indirin. Pipet ucunu görsel rehberlik altında odak noktasına getirin.
- Daha önce gösterilen adımları kullanarak hedeflenen hücreden tam hücre kaydı elde edin33.
- Hücrenin içsel özelliklerindeki değişiklikleri değerlendirmeyi planlıyorsanız (örneğin, giriş direnci, mevcut adımlara yanıt olarak aksiyon potansiyeli ateşleme hızı), bu kayıtları yapın. Aksi takdirde, aşağıdaki akson stimülasyon protokolüne geçin.
Tablo 1: Yapay beyin omurilik sıvısı ve hücre içi çözeltinin bileşimi. eACSF için reaktifler ve konsantrasyonlar ve yama kelepçesi kayıtları için hücre içi pipet çözeltisi listelenmiştir.
| Deney ACSF, eACSF (mM cinsinden) |
| NaCl (Doğal) | 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 20 |
| Kartal | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 |
| glikoz | 10 |
| Dahili Çözüm |
| K-glukonat | 140 |
| NaCl (Doğal) | 10 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 10 |
| EGTA (EGTA) | 0,1 |
| MgATP (MgATP) | 4 |
| NaGTP (NaGTP) | 0,3 |
| pH = 7.2 |
