Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Ameliyat öncesi hazırlıklar
- Elektrot çözeltisi hazırlama
- Elektrot dolgu çözeltisini yapmak için, 140 mM potasyum klorür ile 4 M potasyum asetat çözeltisi hazırlayın.
- Elektrot hazırlama
- Vakumlu emiş kullanarak, bir borosilikat cam kılcal damara (uzunluk = 100 mm, çap = 1.0 mm, iç çap = 0.5 mm) bir T-650 karbon fiber (7 μm çapında) yerleştirin.
- Karbon fiber cam kılcal damarın içine yerleştirildikten sonra, cam kılcalayı, ısıtma elemanı kabaca kılcal damarın ortasında olacak şekilde dikey bir elektrot çekicisine yerleştirin. Mıknatıs kapalıyken ısıtıcıyı 55'e ayarlayın.
- Kılcal damar çekildikten sonra, elektrotun ucu ısıtma elemanı ile çevrelenmeyecek şekilde üst kılcal tutucuyu dikkatlice kaldırın.
- Keskin bir makas kullanarak, kılcal damarın iki parçasını birbirine bağlayan karbon fiberi kesin. Bu, iki ayrı karbon fiber mikroelektrot ile sonuçlanacaktır.
- Işık mikroskobu altında, açıkta kalan karbon fiberi keskin bir neşterle dikkatlice kesin, böylece camın ucundan yaklaşık 75-100 μm öteye uzanır.
- Bir ışık mikroskobu kullanarak, elektrotun kılcal damar boyunca çatlak içermediğinden ve karbon fiberin kılcal damardan çıktığı contanın fark edilmesinin zor olduğundan ve çatlak içermediğinden emin olun.
not: İyi bir sızdırmazlık, kayıtlar sırasında gürültüyü azaltmaya yardımcı olacaktır.
- Referans elektrot imalatı
- Altın bir pimi 5 cm'lik gümüş bir tele lehimleyin.
- Anodu metal bir ataşa veya başka bir iletkene, katodu bir pime takın ve ataş ve gümüş tel 2 M HCl'ye daldırılırken bir voltaj (~0.1 V) uygulayın.
- Gümüş tel üzerinde beyaz bir kaplama (AgCl) göründüğünde voltajı durdurun.
- İmplantasyon için elektrotların hazırlanması
- Altın bir pimi ince yalıtımlı bir tele (~10 cm uzunluğunda, <0,50 mm çapında) lehimleyin.
- Altın pimin karşısındaki telden ~5 cm yalıtımı çıkarın.
- Elektrodu, elektrot çözeltisiyle yaklaşık yarıya kadar doldurun.
- İzole edilmiş kabloyu elektroda yerleştirin.
not: Tel, elektrotun içindeki karbon fiber ile temas etmelidir.
2. Elektrot implantasyonları
- Yetişkin, erkek, Sprague Dawley sıçanlarına (250-450 g) steril salin içinde çözülmüş 0.5 g / mL üretan intraperitoneal enjeksiyon (1.5 g / kg veya 1 mL / kg hacim) verin. 1.0−1.2 g / kg'lık bir başlangıç üretan dozu ile başlayın. Hayvan, üretan uygulamasından 20 dakika sonra zararlı uyaran testine (kuyruk tutam) hala yanıt veriyorsa, toplam 1.5 g / kg doz için ek bir 0.3-0.5 g / kg üretan uygulayın.
not: 0.5 g / mL üretan çözeltisini hazırlamak için, 10 g (~ 10 mL) tuzlu suya 10 g üretan ekleyin. Üretan kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır. Bununla birlikte, ketamin / ksilazin ve kloral hidrat gibi diğer anestezikler gibi dopamin seviyelerini değiştirmediği için önemli bir anesteziktir.
- Hayvan derin bir şekilde uyuşturulduğunda ve zararlı uyaranlara (örneğin, ayak parmağını çimdikleme) yanıt vermediğinde, onu stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Sıçanın her bir gözüne oftalmik kayganlaştırıcı sürün.
not: Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır, ancak iyi bir aseptik teknik teşvik edilir.
- Sıçanın kafa derisini iki aşamalı bir fırçalama kullanarak temizleyin (yani, bir iyodopovidon fırçalayın ve ardından% 70 etanol fırçalayın; 3 döngülü bir tekrarlama ile gerçekleştirin).
- Sterilize edilmiş iğne burunlu cımbız ve cerrahi makas kullanarak kafa derisi dokusunu kesin. Aşağıda özetlenen çeşitli implantasyonlara yer açmak için önemli miktarda doku çıkarın.
- Sterilize edilmiş pamuklu uçlu aplikatörler kullanarak kafatası yüzeyini nazikçe temizleyin. Daha sonra lambda ve bregmayı tanımlamaya yardımcı olmak için 2-3 damla %3 hidrojen peroksit uygulayın.
- Stereotaksik veya el matkabı (1.0 mm, ~20.000 rpm) kullanarak, bregmanın 2.5 mm önünde ve bregmanın 3.5 mm yanında 1.5 mm çapında bir delik açın. Kısmen (yaklaşık yarısına, sıkıca yerine oturana kadar) bu deliğe bir vida (1,59 mm OD, 3,2 mm uzunluğunda) implante edin. Termal yaralanmaları önlemek için delme sırasında sulama yapmak için steril tuzlu su kullanılması tavsiye edilir.
- Referans elektrot için, sol yarımkürede bregmanın 1,5 mm önünde ve 3,5 mm yanlarında 1,0 mm çapında bir delik açın.
- Referans telini implante edilen vidanın başının etrafına ve altına sararken bu deliğe elle ~2 mm referans teli sokun.
- Referans elektrodu yerine sabitleyerek vidayı tamamen implante edin.
- Sağ hemisferde, bregmanın 1,2 mm önünde ve 1,4 mm yanda 1,5 mm çapında bir delik açın.
- Dura'yı cımbız kullanarak nazikçe çıkarın.
- Uyarıcı elektrot için, bregmaya 5.2 mm posterior ve 1.0 mm lateral merkezlenmiş kare bir delik (2 mm ön-arka, 5 mm medial-lateral) açın.
- Stereotaktik kol çubuklarını kullanarak, bipolar uyarıcı elektrodu/kılavuz kanülü duranın 5 mm altına indirin. Elektrotun implantasyonu sırasında kanama olması durumunda, kanamayı en aza indirmek için steril pamuklu çubuklar ve gazlı bez kullanın.
not: Bu yöntemde kullanılan bipolar uyarıcı elektrot, bir kılavuz kanül ile önceden donatılmıştır (Malzeme Tablosu). Bu ürünle birlikte kullanılan dahili kanül, kılavuz kanüle tam olarak yerleştirildiğinde bipolar uyarıcı elektrot üzerindeki uçlar ile yıkanmalıdır. Bu, dahili kanülün, stimülatörün yaklaşık 1 mm aralıklarla oturan iki ucu arasına doğrudan oturmasına izin verecektir. Benzer bir protokol başka bir yerde açıklanmıştır.
- Stereotaktik kol çubuklarını kullanarak karbon fiber mikroelektrodu duranın 4 mm altına indirin. Bu konum striatumun en dorsal kısmındadır.
- Referans kablosunu ve karbon fiberi bir potansiyostata bağlayın.
- 60 Hz'de 15 dakika ve tekrar 10 Hz'de 10 dakika boyunca üçgen bir dalga formu (-0.4−1.3 V, 400 V/s) uygulayın.
not: Tipik olarak, beyindeki karbon fiber mikroelektrotlara dalga formları uygulanırken, karbon fiberin yüzeyine oksit grupları eklenir. Bu reaksiyonun dengesine kayıttan önce ulaşılmalıdır; Aksi takdirde, önemli bir kayma meydana gelecektir19. Elektrodun daha yüksek frekanslarda (60 Hz) çevrilmesi, karbon fiberin daha hızlı dengeye ulaşmasını sağlar.
3. Karbon fiberin optimize edilmesi ve elektrot/kılavuz kanül konumlarının uyarılması
- Stimülatörü, 60 Hz frekans, 24 darbe, 300 μA akım ve 2 ms/faz darbe genişliğine sahip iki kutuplu bir elektrik dalga formu üretecek şekilde ayarlayın.
- Stimülatörü 0,2 mm'lik artışlarla duranın 5 mm'den 7,8 mm altına yavaşça indirin. Her artışta, VTA.
not: Daha fazla sırt derinliğinde (5-6 mm), beynin uyarılması tipik olarak (zamanın ~% ~ 80'i) sıçanın bıyıklarının seğirmesine neden olur. Daha derinlerde, bıyıklar, duranın 7,5-8,2 mm altında meydana gelen seğirmeyi durduracaktır. Bıyıklar seğirmeyi bıraktığında, uyarıcı elektrot VTA'nın yakınında veya yakınında olacaktır. Bu, her sıçanda meydana gelmez ve bıyık seğirmesinin olmaması, bipolar uyarıcı elektrot / infüzyon kanülünün yanlış yerleştirildiğinin bir işareti olarak alınmamalıdır. Bıyık seğirmesi tüm anestezikler için meydana gelmeyebilir (ör., izofluran).
- Bipolar uyarıcı elektrodu/kılavuz kanülü, bir stimülasyon karbon fiber mikroelektrotta (şu anda dorsal striatumda) fazik DA salınımı üretene kadar indirmeye devam edin.
not: Bipolar elektrot VTA'ya implante edilirse dorsal striatumda DA salınımı her zaman meydana gelmez, ancak VTA stimülasyonu üzerine dorsal striatumda DA salınımının gözlenmesi genellikle NAc çekirdeğinde iyi bir sinyalin gözleneceğine dair iyi bir işarettir.
- Karbon fiber mikroelektrodu, duranın en az 6.0 mm altına gelene kadar indirin. Bu, NAc çekirdeğinin en dorsal kısmıdır.
- VTA'yı uyarın ve DA zirvesinin tepe genliğini kaydedin.
- En büyük DA salınımını üreten bölgedeki karbon fiber mikroelektrodu indirin veya yükseltin.
- DA yanıt tepe noktasının 0,6 V'ta net bir oksidasyon zirvesi ve -0,2 V'ta bir indirgeme zirvesi olduğundan emin olun. Bu zirveler DA'yı gösterir.
4. Kombinasyon infüzyonu ve stimülasyon FSCV kaydı
>NOT: Şekil 1, VTA mikroinfüzyonundan önce ve sonra kayıt için zaman çizelgesini göstermektedir.
- Karbon fiber ve uyarıcı elektrot/kılavuz kanül konumu optimize edildikten sonra ~ 20−30 dk.
not: Mevcut stimülasyon parametreleri altında, veziküler yeniden yüklemeye izin vermek için her 3 dakikada bir defadan fazla uyarmayın22.
- Stabil bir taban çizgisine ulaştıktan sonra (beş stimülasyonda %<20 varyasyon), dahili kanülü bipolar stimülatöre önceden takılan kılavuz kanüle elle nazikçe indirin.
- Kanül yerleştirmenin kendisinin uyarılan sinyali değiştirmediğinden emin olmak için ek bir 2-3 temel kayıt alın. Bazı durumlarda, iç kanülün takılması ve çıkarılması VTA'ya zarar verebilir. Sinyal bu referans süre boyunca (%>20) büyük ölçüde değişirse, referans değer yeniden stabilize olana kadar ek 3-4 kayıt yapın.
- Bir şırınga pompası ve mikro şırınga kullanarak, 0.5 μL çözelti demleyin (ör.% 0.9 salin, N-metil-D-aspartat [NMDA], (2R) -amino-5-fosfonovalerik asit [AP5]) 2 dakikalık bir süre boyunca VTA'ya.
- İnfüzyondan sonra, çıkarmadan önce iç kanülü en az 1 dakika bırakın.
not: Bazı ilaçlar, ilaç kinetiğine bağlı olarak iç kanülün daha uzun süre bırakılmasını gerektirebilir ve iç kanülün çıkarılması, ilacın iç kanülden geri çıkmasına neden olabilir. Endişe varsa, kaydın tamamı boyunca dahili kanül kılavuz kanülde bırakılabilir. Aksi takdirde, bu 1 dakikalık aralıktan sonra kayıt başlayabilir.
- İnfüzyon sonrası etkileri ölçmek için her 3 dakikada bir kayda devam edin.
not: Bir kontrol çözeltisi infüze edilirse ve herhangi bir etki gözlenmezse, ikinci kez infüze etmek mümkündür10. Dahili kanül veya salin infüzyonunun yerleştirilmesinden kaynaklanan DA salınımında değişiklik varsa, sinyal tipik olarak 30 dakika içinde taban çizgisine geri döner.
