Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Kayıt için hücre sızdırmazlığı
- Kayda başlamadan önce tüm ekipman parçalarının (mikroskop, amplifikatör, sayısallaştırıcı, mikromanipülatör ve diğerleri) açık olduğundan emin olun.
- Ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) kayıt odasını doldurun, kayıtlar için aCSF solüsyonu ile mikroskoba takın. aCSF'yi 2 mL/dk hızında sürekli olarak perfüze etmek için bir perfüzyon pompası kullanın.
- İlgilendiğiniz bir beyin dilimini (her seferinde bir tane) kayıt odasına aktarın. Hipotalamik dilimleri hazneye aktarmak için akrilik bir transfer pipeti (silikon emziğe bağlı ters Pasteur cam pipet) kullanın. aCSF perfüzyonu sırasında hareket etmemesi için dilimi tutmak için bir dilim ankrajı (Malzeme Tablosu) kullanın.
- Mikroskoba bağlı kayıt odasının ortasına bir dilim yerleştirin. Dilim konumu, mikroskop altında istenen bölgenin iyi bir şekilde görülebilmesi ve kayıt mikropipetinin mükemmel bir şekilde erişilebilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Dilimi konumlandırmaya ve ilgilenilen bölgeyi bulmaya yardımcı olması için bir daldırma mikroskobunun düşük güçlü objektif merceğini (10x veya 20x) kullanın.
- İlgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, objektif lensi yüksek güçlü lense (63x) geçirin ve doku seviyesine odaklanın, endojen floresan proteini ve hedef bölgedeki hücrelerin şekillerini gözlemleyerek kisspeptin hücrelerini bulmak için beyin diliminin yüzeyi
.
- Olası bir hedef hücre bulunduğunda, bunu bilgisayar ekranında fare imleci ile veya ilgilenilen alanın üzerine kare gibi bir format çizerek işaretleyin. Bilgisayar ekran işareti, kayıt yapan mikropipetin konumunu hücreye yönlendirmeye yardımcı olur.
- Hedef hücrenin tam yerini belirledikten sonra, hedefi kaldırın ve dahili çözelti ile doldurulmuş kayıt mikropipetini yerleştirin. Mikropipeti elektrot tutucusuna yerleştirirken, iç çözeltinin gümüş elektrotla temas halinde olduğundan emin olun.
not: Mikropipet hazırlama, yerleştirme ve elektrot tutucuya yerleştirme için.
- Mikropipeti aCSF çözeltisine daldırmadan önce, döküntülerin mikropipete girmesini önlemek için, mikropipet tutucusuna bir polietilen boru (≈130 cm daha uzun) aracılığıyla bağlanan 1-3 mL hava dolu bir şırınga kullanarak pozitif basınç uygulayın; yaklaşık 100-200 μL hava uygulayın.
- Mikromanipülatörü kullanarak, mikropipeti objektifin merkezinin altına yönlendirin. Mikropipeti X-Y-Z ekseninde ilgilenilen hücreye doğru yönlendirmek için mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri hareket ettirin.
- Mikropipetin ucunu görmek için odağı ayarlayın ve odağı dilime çok yaklaştırmayın, ancak çok yaklaştırmayın. Mikromanipülatörün hızını azaltın ve mikropipeti yavaşça odak düzlemine indirin. Mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmediğinden, bunun yerine hücrenin/hedef bölgenin yüzeyine temas edene kadar yavaşça alçaldığından emin olun.
- Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için mikropipet tutucusuna takılı 1-3 mL hava dolu şırınga ile hafif pozitif basınç (≈100 μL) uygulayın.
- Hedef hücreye odaklanın ve mikropipeti ona yaklaştırmak için mikromanipülatörü X-Y-Z ekseninde yavaşça hareket ettirin. Mikropipet hücreye dokunduğunda mikropipet ucundan uygulanan basınçtan kaynaklanan bir çukur gözlenecektir (Şekil 2C).
- Çukuru oluşturduktan sonra, mikropipetin hücreye yakınlığı nedeniyle, mikropipet ile hücre arasındaki sızdırmazlığı oluşturmak için mikropipet tutucusuna bağlı tüpten ağızdan zayıf, kısa bir emme (1-2 s) uygulayın (gigaohm mühür veya gigamühür >1 GΩ; Şekil 2D). Contayı oluşturmak için, yazılımdaki voltaj kelepçesi modunu kullanın.
- Conta sabit kalırsa (gigaohm contası mekanik olarak stabil olmalı ve yaklaşık 1 dakika gözlem ile belirlenen gürültü paraziti olmamalıdır), tutma voltajını ilgili hücrenin en yakın fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın. Kisspeptin hipotalamik nöronlar için -50 mV önerilir.
- Plazma zarını kırmak için hücreye kapatılmış mikropipet ile ağızdan kısa bir emme (negatif basınç) uygulayın (Şekil 2E). Yırtılan zarın mikropipeti tıkamaması ve zarın ve hatta hücrenin önemli bir bölümünü çekmemesi için yeterli kuvvetle emme yapıldığında yeterli tüm hücre konfigürasyonu elde edilir.
- Kullanılan sistem ayarları kılavuzunu kontrol edin. Seri direnci (SR) ve tüm hücre kapasitansını (WCC) dijital olarak kontrol etmek ve hesaplamak için yazılımı (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
- Voltaj kelepçesi modunda, hücre zarını kırdıktan sonra, tüm hücre seçeneğini etkinleştirin ve tüm hücre sekmesine atıfta bulunan Otomatik komutuna tıklayın. Hücrenin SR ve wcc'si otomatik olarak hesaplanacak ve yazılım tarafından anında görüntülenecektir. Bu parametreler, Malzeme Tablosunda belirtilen amplifikatör ile membran testi yapılarak da kontrol edilebilir.
- Hücre canlılık parametrelerini kontrol ettiğinizden emin olun. Kisspeptin nöronları için elektrofizyolojik ölçümlerin şu şekilde olup olmadığını kontrol edin: SR < 25 mΩ, giriş direnci > 0.3 GΩ ve akım mutlak değerini 30 pA< tutun. AVPV / PeNKisspeptin veya ARHkisspeptin nöronlarının WCC'sinin ortalama değeri, gonad sağlam farelerde ≈ 10-12 pF'dir.
- Deneyler sırasında SR ve hücre kararlı durum kapasitansını izleyin. Kayıt sırasında SR'nin %20'den fazla değişmediğinden ve membran kapasitansının stabil olduğundan emin olun.
- Yazılım ayarlarını kontrol edin. Deney türüne göre kayıtlar için özel protokoller oluşturun. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, Malzeme Tablosunda belirtilen ekipmanla, alçak geçiren elektrofizyolojik sinyalleri 2-4 kHz'de filtreleyin ve sonuçları yazılımda çevrimdışı olarak analiz edin (yazılım bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın).
- Tüm hücre konfigürasyonu düzgün bir şekilde elde edildiğinde, voltaj kelepçesi modunda sinaptik akımları ölçün (Şekil 2G). Dinlenme membran potansiyelindeki (RMP) değişiklikleri ve akım kelepçesi modunda indüklenen RMP varyasyonlarını kaydedin (Şekil 2H). Hücre zarının depolarizasyonu gibi RMP'deki değişiklikler, Şekil 1.
'de gösterildiği gibi, bilinen bir ilacın / nörotransmiterin banyoya (adım 1.2'de açıklanmıştır) uygulanmasıyla indüklenebilir
not: Akım-kelepçe modunda, membran voltajını istenen bir voltajda tutmak için pozitif veya negatif akım enjekte edilebilir. Kisspeptin nöronları için, zar potansiyelinin spontan değişimini kaydetmek için genellikle sıfır akım enjeksiyonu (I = 0) ayarlarız.
