$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İn vitro elektrofizyoloji
- Omurilik dilimi hazırlanması ve kaydedilmesi için solüsyonların hazırlanması
- Yapay beyin omurilik sıvısı
not: Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF), dilimlerin kayıt başlayana kadar ve deneyler sırasında ilaçlar için hem perfüze hem de seyreltici olarak saklandığı bir arayüz inkübasyon odasında kullanılır. Ayrıntılı kompozisyon için Tablo 1'e bakın.
- 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glikoz, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 ve 2.5 CaCl2 içeren aCSF'yi, CaCl2 hariç yukarıdakilerin gerekli miktarlarını 2 L damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın.
- Yukarıdaki çözeltiyi 5 dakika boyunca karbojen (%95 O2,% 5 CO2) ile köpürtün ve CaCl2.
ekleyin
not: Bu adım CaCl2 çökelmesini önler, yani çözelti bulanıklaşmamalıdır. Deneyler sırasında ilaç uygulaması için, aCSF'deki ilaç stok çözeltilerini istenen nihai konsantrasyonlara seyreltin.
2. Sükroz ikameli yapay beyin omurilik sıvısı
>NOT: Sükroz ikameli aCSF, diseksiyon ve omurilik dilimleme sırasında kullanılır. Adından da anlaşılacağı gibi, ozmolariteyi korurken bu prosedürler sırasında nöronal uyarımı azaltmak için sükroz NaCl ile ikame edilir. Ayrıntılı kompozisyon için Tablo 1'e bakın.
- 250 sakaroz, 25 NaHCO3, 10 glikoz, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 ve 2.5 CaCl2 içeren (mM cinsinden) sakaroz ikameli aCSF'yi, CaCl2 hariç yukarıdakilerin tümünün gerekli miktarlarını 300 mL damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın.
- Çözeltiyi 5 dakika boyunca karbojen ile köpürtün ve ardından CaCl2 ekleyin.
- Çözeltiyi -80 ° C'lik bir dondurucuda yaklaşık 40 dakika veya çözelti bir bulamaç oluşturana kadar saklayın. Katı halde dondurmaktan kaçının ve bulamaç kıvamında kullanın.
3. Mikroelektrot dizisi hazırlama
NOT: MEA'nın temas yüzeyi, onu hidrofilik hale getirmek için bir ön işlem gerektirir.
- Deneyden önce, MEA'yı 30 dakika boyunca fetal sığır serumu (FBS) veya at serumu (HS) ile iyice doldurun.
- FBS veya HS'yi çıkarın ve damıtılmış su artık köpüklü olmayana kadar MEA'yı yaklaşık beş yıkama damıtılmış su ile iyice durulayın. Kuyuyu kullanıma hazır aCSF ile doldurun.
4. Akut omurilik dilimi hazırlığı
- Fareyi 100 mg / kg ketamin (ip) ile derinlemesine uyuşturun ve ardından büyük cerrahi makas kullanarak kafasını çıkarın.
- Kalça hizasındaki deride küçük bir kesi yaparak karın bölgesinin üzerindeki cildi çıkarın. Tüm deri çıkarılana kadar, yani göğüs kafesinin tepesinden pelvisin tepesine (hem ventral hem de dorsal) kadar kesilen her iki taraftaki cildi rostral olarak çekin.
- Vücudu buzun üzerine yerleştirin ve tüm iç organları çıkararak ve sternumun yanındaki kaburgaları keserek vertebral kolonu ortaya çıkarmak için ventral bir yaklaşım kullanın.
- Ventral göğüs kafesini, her iki kürek kemiğini (yaklaşık T2'de kesilmiş) ve alt ekstremiteleri ve pelvisi (yaklaşık olarak sakrumun tepesinde kesilmiş) çıkarın.
- Vertebra kolonu ve kaburga preparatını buz gibi soğuk sükroz aCSF içeren bir diseksiyon banyosuna aktarın. Hazırlığın dört köşesini de (ventral yüzey yukarı doğru) alt sırt kaslarından ve bağlı üst kaburgalardan pimler yerleştirerek sabitleyin.
- Omurların ventral yüzeyinin üzerindeki tüm kas ve bağ dokusunu rongeurlarla çıkarın ve yaklaşık olarak T12 ila L2 omur gövdelerinin altında yer alan lumbosakral genişleme üzerindeki vertebral bölgeyi belirleyin.
- Vertebra kanalında otururken omuriliğe erişim sağlamak için lumbosakral genişleme bölgesine kaudal olan bir omur gövdesini çıkarın.
- Kavisli yaylı makas kullanarak, omurların ventral ve dorsal yönlerini ayırmak ve omuriliği ortaya çıkarmak için omur gövdesini rostral olarak kaldırırken ve çekerken vertebral pedikülleri iki taraflı olarak kesin.
- Lumbosakral genişlemeyi ortaya çıkarmak için omur gövdeleri çıkarıldıktan sonra, omuriliği sabitleyen kalan kökleri, kordon serbest kalana kadar yaylı makasla dikkatlice temizleyin.
- Omuriliği, lumbosakral genişlemenin çok üstünde ve altında rostral ve kaudal kesiklerle izole edin, böylece kordun hedef bölgesinin 'serbestçe yüzmesine' izin verin.
not: Tercih edilen dilim yönü, kablonun daha sonra kesit alma için nasıl monte edileceğini belirleyecektir (Şekil 1).
- Enine dilimler için, lumbosakral segmenti bağlı bir kökten kaldırın ve ortasında sığ bir kanal kesilmiş önceden kesilmiş bir polistiren (strafor) blok (1 cm x 1 cm x 1 cm) üzerine yerleştirin. Bloğu ve kordonu kesit platformuna takmak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın (Malzeme Tablosuna bakın) ve buz gibi soğuk sükroz aCSF (bulamaç) içeren kesme banyosuna yerleştirin.
not: Sığ kanal, sırt tarafı açıkta ve kordun torasik ucu bloğun altında olacak şekilde omuriliği sabitlemeye ve yönlendirmeye yardımcı olur.
- Sagital dilimler için, kesit platformuna ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı çizgisi yerleştirin, lumbosakral genişlemeyi bağlı bir kökle kaldırın ve kordonu tutkal hattı boyunca yerleştirin, bir yan yüzeyin yapıştırıcının içinde ve diğerinin yukarı baktığından emin olun. Buz gibi soğuk sükroz aCSF (bulamaç) içeren kesme banyosuna yerleştirin.
- Yatay dilimler için, kesit platformuna ince bir çizgi siyanoakrilat yapıştırıcı koyun. Lumbosakral genişlemeyi bağlı bir kökle kaldırın ve lumbosakral genişlemeyi yapıştırıcı hattı boyunca yerleştirin, ventral yüzeyin yapıştırıcının içinde olduğundan ve sırt yüzeyinin yukarı baktığından emin olun. Kabloyu konumlandırmak için bağlı kökleri kullanın. Buz gibi soğuk sükroz aCSF (bulamaç) içeren kesme banyosuna yerleştirin.
5. Mikroelektrot dizisi kayıtları
>NOT: Aşağıdaki adımlar, omurilik dilimleri üzerinde MEA tabanlı deneylerden elde edilen kayıt verilerinin nasıl kullanılacağını ayrıntılarıyla açıklar. Deneye bağlı olarak birkaç MEA tasarımı kullanılabilir. Bu deneylerde kullanılan MEA'lar için tasarım detayları Tablo 2 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Ayrıntılı tasarım bilgileri Egert ve ark. ve Thiebaud ve ark. tarafından düzlemsel ve 3 boyutlu (3D) MEA'lar için yayınlanmıştır. Her iki MEA tipi de silikon nitrür yalıtım tabakası ve titanyum nitrür izleri ve temas pedleri ile 60 titanyum nitrür elektrottan oluşur.
- Deney düzeneği
- Bilgisayarı ve arayüz kartını açın ve kayıt yazılımını başlatın.
- Önceden monte edilmiş kayıt şablonunu yükleyin (Şekil 3A). Kaydedici sekmesinde günün dosyalarını adlandırın.
- Deney süresince aCSF'yi sürekli olarak karbojen (%5 CO2,% 95 O2) ile köpürtün.
- Peristaltik bir pompa tarafından kontrol edilen perfüzyon sistemini açın. Giriş hattını aCSF'ye yerleştirin ve giriş ucunu bir atık kabına yerleştirin. Perfüzyon hatlarını aCSF ile astarlayın.
- 50 mL aCSF'deki stokları gerekli nihai konsantrasyona seyrelterek 4-AP ve diğer ilaç çözeltilerini hazırlayın (ör., 4-AP için 200 μM).
- 4-aminopiridin (4-AP) aktivitesi
- İnkübasyonun ardından, aCSF ile doldurulmuş geniş uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak inkübatörden tek bir dilim aktarın.
- Dilimi MEA kuyucuğuna yerleştirin ve ilave aCSF ekleyin.
- İnce kısa bir saç boya fırçası kullanarak dilimi 60 elektrotlu kayıt dizisinin üzerine yerleştirin. Özellikle 3D diziler kullanıyorsanız, elektrotları boya fırçasıyla temas ettirmekten veya dokuyu elektrotlar boyunca sürüklemekten kaçının.
not: MEA düzenine bağlı olarak, bu, doğru konumlandırma için bir mikroskop yardımı ile veya mikroskop yardımı olmadan yapılabilir.
- Dilimi yerleştirdikten sonra, yerinde tutmak ve MEA elektrotlarıyla iyi bir temas sağlamak için dokunun üzerine ağırlıklı bir ağ yerleştirin.
not: Net yerleşimin ardından dilimin yeniden konumlandırılması gerekebilir.
- MEA'yı kayıt başlığına yerleştirintage (Şekil 2A, B).
- Yüzeysel dorsal boynuzun (SDH) altında mümkün olduğunca çok elektrotun olduğunu doğrulamak için ters çevrilmiş bir mikroskop (2x büyütme) kullanarak dokunun elektrotlar üzerindeki konumunu kontrol edin. En az 2-6 elektrotun dilime temas etmediğinden emin olun, çünkü bu elektrotlar analiz sırasında gürültüyü çıkarmak ve artefaktları kaydetmek için önemlidir (Şekil 2E).
- Kamerayı açın, cihaza bağlayın ve analiz sırasında kullanmak için MEA'ya göre dilimin referans görüntüsünü alın.
- Kayıt yazılımında Start DAQ (veri toplama) düğmesine basın ve tüm elektrotların net bir sinyal aldığını onaylayın.
not: Sinyal gürültülüyse, başlığın klipsini açıntage ve hem MEA temas pedlerini hem de altın yaylı temas noktalarını %70 etanol ile temizleyin (temizlikten sonra pedlerin ve temas noktalarının kuru olduğundan emin olmak için bir laboratuvar mendili kullanın). Sinyal hala gürültülüyse, kayıt yazılımındaki arızalı elektrotları kapatın veya analiz sırasında daha sonra hariç tutmak için not edin.
- Perfüzyon giriş ve çıkış hatlarını MEA kuyusuna (önceden aCSF ile doldurulmuş) takın ve perfüzyon sistemini açın. Akış hızını, ideal olarak dakikada 4-6 banyo hacmini kontrol edin ve süper füzatın taşmasını önlemek için çıkış akışının yeterli olduğundan emin olun.
- Dokunun 5 dakika boyunca dengelenmesine izin verin ve ardından 5 dakikalık ham, filtrelenmemiş temel verileri kaydedin.
- Perfüzyon giriş hattını aCSF'den 4-AP çözeltisine taşıyın ve 4-AP ile indüklenen ritmik aktivitenin kararlı duruma ulaşması için 12 dakika bekleyin (ilaçların banyoya ulaşması için 2 dakika ve aktivitenin zirveye ulaşması için 10 dakika ve ardından plato).
- 5 dakikalık 4-AP kaynaklı aktiviteyi kaydedin. İlaçları test etmek veya 4-AP'nin stabilitesini kontrol etmek için sonraki kayıtlara hazırlıklı olun.
Tablo 1: Yapay Beyin Omurilik Sıvısı bileşimleri.
adet
| kimyasal | aCSF (mM) | aCSF (g/100 mL) | Sükroz ikameli aCSF (mM) | Sükroz ikameli aCSF (g/100 mL) | Yüksek potasyumlu aCSF (mM) | Yüksek potasyumlu aCSF (g/100 mL) |
| Sodyum klorür (NaCl) | 118 | 0,690 | - | - | 118 | 0,690 |
| Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| glikoz | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 |
| Potasyum klorür (KCl) | 2,5 | 0,019 | 2,5 | 0,019 | 4.5 | 0,034 |
| Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Magnezyum klorid (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Kalsiyum klorür (CaCl2) | 2,5 | 0,028 | 2,5 | 0,028 | 2,5 | 0,028 |
| Sakaroz | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tablo 2: Mikroelektrot dizisi düzenleri.
| Mikroelektrot Dizi Düzenleri |
| Mikroelektrot Dizi Modeli | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12 / 40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Düzlemsel veya 3 Boyutlu (3D) | Düzlemsel | 3d | 3d | Düzlemsel |
| Elektrot Izgarası | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 × 10 |
| Elektrot Aralığı | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Elektrot Çapı | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Elektrot Yüksekliği (3D) | Yok | 40 μm | 50 μm | Yok |
| Deney | Enine dilim | Enine dilim | Sagital + Yatay | Sagital + Yatay |
