Sıçanlarda Arteriyel Basınca Yanıt Olarak Renal Sempatik Sinir Aktivitesindeki Değişikliklerin Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Fink, A. M., et al. Anestezi Uygulanmış Sıçanlarda Merkezi Sinir Sistemi Manipülasyonlarına Yanıt Olarak Renal Sempatik Sinir Aktivitesindeki Akut Değişikliklerin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, sıçanlarda arteriyel basınçtaki değişikliklere yanıt olarak renal sempatik sinirlerin (RSN'ler) aktivitesini inceleme tekniğini göstermektedir. Femoral artere basınç algılayıcı bir kateter takıldıktan sonra, böbrek sempatik sinirler açığa çıkar. Sinirler daha sonra bir kayıt elektroduna kaldırılır ve elektriksel aktiviteleri kaydedilir. Daha sonra, kan basıncını yükseltmek için vazokonstriktör bir ilaç enjekte edilir ve RSN aktivitesindeki karşılık gelen değişiklikler izlenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Bipolar RSNA Elektrotları Oluşturun

1. Elektrodu oluşturmak için, her biri yaklaşık 18 mm uzunluğunda iki parça paslanmaz çelik tel kesin. Yaklaşık 15 mm uzunluğunda bir parça polietilen (PE-50) boru kesin. Her iki tel parçasını da boruya besleyin ve teli her iki uçtan çıkıntı yapacak şekilde bırakın.
2. Tellerin uçlarından yalıtımı çıkarın; 2-3 mm açıkta kalan tel bırakarak telleri kesin. Bir ucunda, açıkta kalan telin üzerine erkek pimleri kıvırın. Pimleri kabloya sağlam bir şekilde lehimleyin, pimleri bir konektör şeridinin içine sabitleyin ve bağlantıyı epoxy.
   ile kapatın not: Lehimlemeyi önleyen alternatif bir yaklaşım, hızlı bağlantı/serbest bırakma timsah klipsleri kullanmaktır.
3. Elektrotun diğer ucunda, 2-3 mm açıkta tel bırakarak tellerin uçlarından yalıtımı çıkarın. Yalıtımsız telde küçük "V" şeklinde kancalar oluşturmak için tellerin bu kısmını bükün.
   not: Bu, elektrotun renal sempatik sinir ile temas edecek kısmıdır. Sıvıların boruya girmesini önlemek için bu ucun kapatılması önemlidir. Silikon veya epoksi etkin bir şekilde kullanılabilir.

2. Anestezi uygulayın ve cerrahi bölgeleri hazırlayın

1. Bir erkek Sprague Dawley sıçanına (9-11 haftalık, 150-400 g ağırlığında) anestezi uygulayın. İntraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile pentobarbital sodyum 50 mg / kg uygulayın. Ameliyat sırasında stabil bir anestezi düzlemini değerlendirmek için, her 15 dakikada bir ayak parmağını kıstırma refleksini kontrol edin ve gerekirse anesteziyi yeniden dozlayın.
   not: Pentobarbital sodyum (Nembutal), önceki çalışmalarda RSNA'nın modülasyonuna müdahale etmeden sürekli bir anestezi düzlemi elde etmek için kullanılmıştır. Bu protokol sağkalım dışı cerrahi içindir, bu nedenle iyileşme/ameliyat sonrası izleme süresi yoktur.
2. Cerrahi bölgeyi kurumsal hayvan bakımı yönergelerine göre hazırlayın (yani, farenin karınını, sırtını ve başını tıraş edin; cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ile temizleyin; göz kayganlaştırıcı uygulayın; ve fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin). Deneyler sırasında vücut ısısını 37 °C'de tutun.

>3. Ortalama arteriyel basınç izleme için femoral arteri kanüle

edin

1. Arteri mikroskop altında görselleştirin. Venöz kanülasyon için kullanılan yönteme benzer şekilde, arteri tıkamak için distal sütürü bağlayın; Bu dikişin kenarlarını ipek bantla cerrahi alana sabitleyin ve arteri cerrahın baskın eline dik olarak konumlandırın.
2. Telemetri kullanılıyorsa arteriyel erişim
   1. Arteriyel kanülasyondan önce basınç algılama kateterini yüksek büyütme altında inceleyin. Kateterde kabarcık/kalıntı olmadığından ve sıvı dolu (proksimal) ve jel dolu (distal) bileşenler arasında sağlam bir menisküs olduğundan emin olun. Her implantasyondan önce, kateterin distal ucundaki jeli tekrar doldurun. Bir mıknatıs kullanarak vericiyi açın; mükemmel yerleştirmeye dayanmak için ameliyat sırasında kan basıncını (BP) izleyin.
   2. Femoral arteri kısa bir süre tıkamak için proksimal sütürde gevşek bir el üstü yarım düğüm kullanın. Kateter tanıtıcısını baskın olmayan elinizde tutun. Uçtan jelin yer değiştirmesini önlemek için telemetri ünitesinin kanülünün ucunu damar kanülasyon forseps ile tutun.
   3. Bükülmüş 22G iğne ile arterde bir delik açın ve jelin uçtan çıkmasını önlemek için kanülü damar kanülasyon forseps kullanarak artere yerleştirin. Kanülü mümkün olduğunca ilerletin. Proksimal ve distal sütür bağlarını kullanarak basınç kateterini sabitleyin.
   4. Telemetri implantının gövdesini insizyona bitişik yan tarafın içine sokun ve bu insizyonu bir kesme iğnesi üzerinde 4-0 naylon sütür kullanarak kapatın. Pil ömrünü korumak için kayıt süresinin sonunda telemetri cihazlarını mıknatısla kapatın.

4. Beyne erişmek için fareyi stereotaksik cerrahi çerçevesine yerleştirin

1. Fareyi stereotaksik cerrahi çerçevesinde yavaşça yüzüstü pozisyona getirin.
2. Fareyi kulak çubukları arasına yerleştirin ve lambda ve bregma yüksekliğini eşitlemek için kesici çubuğu ayarlayın. Konumlandırma, sıçan suşuna, ağırlığına ve merkezi sinir sistemi (CNS) hedeflerinin konumlarına bağlı olabilir.
3. Kafa derisinin orta hattından 2 cm'lik bir rostrokaudal neşter kesisi yapın. Pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, kafatası yüzeyindeki bağ dokusunu sıkıca çıkarın. Bregma, lambda ve orta hat dikişlerini görselleştirmeye yardımcı olmak için kafatasına hidrojen peroksit uygulayın.
4. Hedeflemeyi yönlendirmek için sıçan beyninin bir atlasını kullanarak, kafatasının içinden elektrot erişimi için boyutlandırılmış bir çapak deliği osteotomisi açın.

>5. Renal Sempatik Sinirlerin İzole Edilmesi

1. Tel RSNA elektrodunu (Adım 1.1-1.3) 10X ön amplifikatöre ve mikroelektrot amplifikatörüne bağlayın.
2. Sıçan stereotaksik çerçeveye sabitlenmeden önce veya sonra retroperitoneal bir insizyon yoluyla böbrek sinirlerini izole edin. Sıçan stereotaksik çerçeveye girdikten sonra RSNA elektrotlarını konumlandırın. Kaburgaların 4-5 cm altından kaudal yönde, omurganın hafif yanatına uzanan bir neşter kesisi yapın. Blunt, paraspinal kasları görselleştirmek için insizyonu inceler.
3. Yağın kasla buluştuğu yerde çok yüzeysel 1-2 cm'lik rostrokaudal bir kesi yapmak için makas kullanın. Pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, böbreği görselleştirmek için yağı kastan uzaklaştırın. Periton boşluğuna girmemek önemlidir.
4. Renal arteri ve abdominal aortu görselleştirmek için böbreği paraspinal kaslardan nazikçe ayırmak için ekartörler kullanın. Böbrek sinirlerine zarar vermemek için damarları aşırı germeyin. Böbreği yaralanmadan korumak için tuzlu suya batırılmış 2 "x 2" pamuklu gazlı bez kullanın.
5. Yüksek büyütme altında, insizyon cebindeki böbrek sinirlerini tanımlayın. Sinir demetleri en kolay aort ve renal arterin oluşturduğu dik açıda görülebilir. Böbrek sinirleri, aorttan böbreklere giden böbrek atardamarını yakından takip eder.
6. Kayıt elektroduna yerleştirilecek sinir demetinin bir segmentini seçin. Mikro diseksiyon cımbızı kullanarak sinir liflerini çevreleyen dokudan / damardan nazikçe inceleyin.
7. Tel RSNA elektrodunu bir tutucuya sabitleyin (örneğin, bir destek standına bağlı bir timsah klipsi). Elektrodu sinir segmenti seviyesine indirin. Siniri germeden renal sinirin segmentini elektrot üzerine nazikçe kaldırmak için bir sinir kancası kullanın.
   not: Sinir, yalıtımsız tel içindeki "V" şeklindeki her iki kancanın içinde, sinire paralel olarak durmalıdır. Elektrot telleri başka herhangi bir dokuya, kana veya lenf sıvısına temas etmemelidir.
8. Açıkta kalan böbrek sempatik sinirin kurumasını önlemek için kesiği mineral yağ ile doldurun. Bir ucu insizyonun derisi üzerinde ve diğer ucu Faraday kafesine bağlı bir topraklama klipsi kullanın.
9. Yüksek ve alçak geçiren filtreleme (10 Hz ve 3 kHz) kullanarak sinyali amplifikatörlere yönlendirin. Kazancı 10 K'ya kadar ayarlayın. RSNA'nın patlama modelini değerlendirmek için bir ses monitörü ekleyin. 2.000-10.000 Hz arasında değişen örnekleme hızlarını kullanın. Bir CNS manipülasyonunun hızlı / kısa sempatik yanıtlara neden olduğu varsayıldığında artan bir örnekleme oranı kullanın.

6. Verileri Kaydet

1. İntravenöz olarak 1 mL salin veya 10 μg / mL fenilefrin (0.1 mL'de) bolus enjeksiyonu ile barorefleksi uyandırarak RSNA kaydının kalitesini değerlendirin. Şekil 1'de gösterildiği gibi, infüzyon BP'yi arttırmalı ve RSNA'yı inhibe etmelidir. Ortalama arter basıncında 60-80 mmHg'lık bir artış renal sempatoinhibisyon için yeterlidir.
2. Gerekirse sinyali iyileştirmek için elektrotların konumunu ayarlayın. Sinir, elektrot üzerindeki her iki kanca ile temas halinde değilse veya tellerle herhangi bir doku, kan veya lenf sıvısı temas halindeyse yeniden konumlandırma gerekir.
   not: Yeniden konumlandırma ihtiyacı, sinir deşarjlarının işitsel özelliklerine dayanmaktadır.
3. Net bir sinyal elde edildiğinde, mineral yağı çekerek ve insizyon cebindeki sinir/elektrot bağlantısını kapatmak için bir silika jel uygulayarak RSNA elektrodunu yerine sabitleyin. Jel tamamen sertleşmeden fareyi hareket ettirmeyin.
4. RSNA'yı ve ortalama arteriyel basıncı sürekli olarak kaydederken CNS manipülasyon protokollerini gerçekleştirin. Beyin sapı manipülasyonları için bir mikroenjektör/pulser kullanılıyorsa, CNS manipülasyonlarının zamanlamasını belgelemek için RSNA/BP kayıtlarına bu cihazdan bir mantık sinyali verilebilir.
5. Deney tamamlandığında, silika jel ile omurilik kası arasındaki kayıt elektrotlarının proksimalindeki siniri ezerek gürültü seviyesini belirleyin. RSNA için bu "sıfır" değerinin en az 30 saniyesini kaydedin. Gürültüyü ölçmek için alternatif bir yaklaşım olarak, atropin, heksametiyum, klorizondamin veya pentolinyum tartrat gibi kısa etkili bir ganglionik bloker uygulayın.
6. RSNA elektrodunu dikkatlice çıkarın ve tel elektrotlardaki silika jel kalıntılarını temizleyin. Elektrodu yeniden kullanmak üzere saklayın. Kateterin ucuna zarar vermemeye dikkat ederek telemetri vericisini kapatın ve çıkarın.

Sonuçlar

Şekil 1: Fenilefrin enjeksiyonu IV'e yanıt olarak RSNA ve BP.Ham RSNA (A) tam dalga doğrultuldu (B); doğrultulmuş ezilmiş "sıfır" RSNA, ek C'de gösterilir. Örtüşmeyen 10 sn ortalamalar (eksi gürültü) hesaplandı (D). Barorefleksi uyandırmak için 0.1 mL fenilefrin (1 μg/mL) intravenöz olarak (ok atında) enjekte edildi. Bolus infüzyonu, ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Paslanmaz çelik tel	A-M Sistemleri; Sequim, WA	791000	RSNA elektrodu
Polietilen (PE-50) boru	VWR; Radnor, Pensilvanya	63019-048	RSNA elektrodu; damar kanülasyonu
Minyatür pim konektörü	A-M Sistemleri; Sequim, WA	520200	RSNA elektrodu
Sıkma aracı	Daniels İmalat A.Ş.; Orlando, Florida	M22520	RSNA elektrodu
Bağlantı şeridi	Amphenol; Clinton İlçesi, MI	221-2653	RSNA elektrodu
JB Kwik Epoksi	J-B Kaynak, Kükürt Yayları, TX	8270	RSNA elektrodu
silikon	Permatex; Hartford, Otomotiv	2222	RSNA elektrodu
Heparin sodyum; Enjekte edilebilir (10 mL şişe, 1000 U / mL)	KV Veteriner Malzemeleri; David Şehri, NE	P03466 Serisi	Venöz hat açıklığı
Fenilefrin HCl; Enjekte edilebilir (1 mL şişe; 10 mg / mL)	ACE Cerrahi Tedarik; Brockton, MA	950-6312	Renal sempatoinhibisyonun test edilmesi
Tek kancalı elastik cerrahi kalışlar	Harvard Aygıtı; Holliston, Yüksek Lisans	72-2595	Kesi
İpek cerrahi bant	3M, Minneapolis, MN	1538-0	Güvenli cerrahi kalışlar
iğneler, 20 g	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	Z192554-100EA	Damar kanülasyonu
Dumont #7 kavisli forseps	Güzel Bilim Araçları; Foster Şehir, Kaliforniya	11274-20	Damar kanülasyonu
5-0 İpek Dikiş Bağları	Braintree Bilimsel; Beyin Ağacı, MA	SÜT-S 106	Damar kanülasyonu
Hassas hemostatik forseps	Roboz Cerrahi Alet A.Ş.; Gaithersburg, MD	RS-7117	Damar kanülasyonu ve RSNA cerrahisi
Crile Hemostatik forseps	Güzel Bilim Araçları; Foster Şehir, Kaliforniya	13004-14	İğne bükme
Telemetri vericisi	Veri Bilimleri Uluslararası; Minneapolis, MN	PA-10	Ortalama arteriyel basınç monitörizasyonu (telemetri)
Yeniden jel şırınga	Veri Bilimleri Uluslararası; Minneapolis, MN	276-0038-001	Vericinin yeniden kullanımı (telemetri)
Tek kullanımlık basınç dönüştürücü	Transpac; San Clemente, Kaliforniya	MI-1224	Ortalama arteriyel basınç izleme
Clear-Cuff basınçlı demlik	MILA Uluslararası A.Ş.; Floransa, KY	2281339	Ortalama arteriyel basınç izleme
Damar kanülasyon forsepsleri	Güzel Bilim Araçları; Foster Şehir, Kaliforniya	00574-11	Kateter takılması
Ters kesme iğnesi üzerinde siyah monofilament naylon 4-0 sütür	McKesson Tıbbi-Cerrahi; San Francisco, Kaliforniya	S661GX Serisi	Güvenli telemetri vericisi
Telemetri alıcısı	Veri Bilimleri Uluslararası; Minneapolis, MN	RPC-1	Ortalama arteriyel basınç monitörizasyonu (telemetri)
LabChart Pro (yazılım), PowerLab (satın alma donanımı)	AD Enstrümanları; Colorado Kaplıcaları, CO	ML846, MX2 matrix 2.0 (Data Science International telemetrisi ile uyumlu)	Yazılım/edinim donanımı için 3 seçenek
SciWorks (yazılım), DataWave (satın alma donanımı)	DataWave Teknolojileri, Loveland, CO	Yok
Spike 2 (yazılım), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Londra, İngiltere	1401-3
Mikro matkap	Roboz Cerrahi Alet A.Ş.; Gaithersburg, MD	RS-6300	CNS cerrahisi
Stereotaksik cerrahi çerçevesi	Çalmak; Ahşap Dale, IL	51600	CNS cerrahisi
10X ön amplifikatörlü mikroelektrot amplifikatörü	A-M Sistemleri; Sequim, WA	1800-2	RSNA kaydı
Ekartörler	Güzel Bilim Araçları; Foster Şehir, Kaliforniya	17009-07	RSNA kaydı
Mikro diseksiyon cımbız	Güzel Bilim Araçları; Foster Şehir, Kaliforniya	11251-10	RSNA kaydı
Mikro kanca	Güzel Bilim Araçları; Foster Şehir, Kaliforniya	10064-14	RSNA kaydı
Mineral yağ	Fisher Bilimsel; Waltham, Yüksek Lisans	8042-47-5	RSNA kaydı
Ses monitörü	A-M Sistemleri; Sequim, WA	3300	RSNA kaydı
Silika jel	Wacker, Münih; Almanya	RT601A-B	RSNA kaydı
Elektrik klipsleri	Tyco Elektronik; Schaffhausen, İsviçre	EB0283-000	Perfüzyon iğnesinin topraklanması veya sabitlenmesi
Bonn makası, düz/keskin uçlar	Roboz Cerrahi Alet A.Ş; Gaithersburg, MD	RS-5840	Perfüzyon
Gavaj iğnesi	Harvard Aygıtı; Holliston, Yüksek Lisans	75-0286	Perfüzyon
Masterflex perfüzyon pompası	Cole-Parmer; Vernon Tepeleri, IL	7524-10	Perfüzyon
Masterflex platinle kürlenmiş silikon boru	Cole-Parmer; Vernon Tepeleri, IL	96410-15	Perfüzyon
Formalin (% 10 tamponlu çözelti; 4 L)	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	HT501128	Perfüzyon
Sakaroz	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	S0389 Serisi	Kriyo koruma