$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Tüm hücre yama kelepçesi kayıtları
- İlk doku bölümünü, sürekli bir Krebs çözeltisi akışına batırılmış kayıt odasına aktarın. Hafif ağırlıklar kullanarak bölümü monte edin ve hedefi suya daldırın.
- Mikroskopta striatal bölgeyi tanımlayın ve GFP pozitif (yeniden programlanmış) nöronları arayın. Morfolojisi geniş olan ve lif demetleri veya kan damarları ile kaplı olmayan bir nöron seçin.
- Yama için borosilikat cam pipetleri (3-7 MΩ) hazırlayın ve aşağıdaki hücre içi çözelti (mM cinsinden) ile doldurun: 122.5 potasyum glukonat, 12.5 KCl, 0.2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0.3 Na3GTP ve 8 NaCl, KOH ile pH 7.3'e ayarlanmış.
- Cam pipeti kayıt elektroduna takın ve solüsyona batırın. Elektrotun direncini iki kez kontrol edin. Ardından, ucun tıkanmasını önlemek için elektrot üzerinde hafif bir pozitif basınç uygulayarak pipetle hücreye yavaşça yaklaşın.
Dikkat: Elektrodu inerken hücrenizi takip etmeye ve hücredeki floresansı ağartmamaya dikkat edin (yani, ihtiyacınız olmadığında floresan lambayı kapatın).
- Elektrotun pozitif basıncını kullanarak çevredeki dokuyu dikkatlice durulayın ve elektrotla hücreye yaklaşın. Elektrodu hücrenin tam üstüne yerleştirin ve elektrot zara temas edene kadar alçalın. Elektrot ve hücre zarı arasında Giga-Ω bir sızdırmazlık sağlayın ve negatif basınç darbeleriyle, tam hücre yaması oluşturmak için zarı yırtın.
Dikkat: Yeniden programlanmış nöronlar hassastır. Yama yaparken dikkatli olun ve Giga Ω bir contaya ulaşırken veya hücre zarını açarken çok fazla negatif basınç uygulamayın. Ayrıca, yaşlı hayvanlara yama yapmak, bağ dokuları daha kalın olduğundan ve nöronları görselleştirmek daha zor olduğundan pratik ve sabır gerektirir.
- Akım-kelepçe modunda kırıldıktan hemen sonra dinlenme membran potansiyellerini kontrol edin ve analiz için not edin.
- Akım kelepçesinde, hücreyi -60 mV ila -80 mV arasında tutun ve aksiyon potansiyellerini indüklemek için 10 pA'lık artışlarla -20 pA ila +90 pA arasında 500 ms akım enjekte edin.