Görüntü Sinirsel Aktivitelerine Transgenik Farelerin Beynine Optik Pencerelerin Yerleştirilmesi

Özet

Kaynak: Lin, X., et al. Thy1-GCaMP6s Transgenik Fareler Kullanılarak Primer Somatosensoriyel Kortekste Nöral Aktivitenin Görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, transgenik farelerde optik bir pencereden beynin nöral aktivite kaydını göstermektedir. Fareler, sinirsel aktivitelerin tespit edilmesini sağlayan bir floresan proteini eksprese eder. Kafatasının küçük bir kısmı, optik bir pencere takmak için dikkatlice çıkarılır ve daha sonra görüntülemeden önce ışığı engellemek için kafatası siyah çimento ile kaplanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hayvanı Görüntülemeye Hazırlama

1. Ameliyat alanına steril gazlı bez, pamuklu çubuklar ve otoklavlanmış cerrahi aletler yerleştirin. Cerrahi aletlerin ameliyatlar arası sterilizasyonu için bir Mikro Boncuk Sterilizatörünü açın.
2. Fareyi (erkek veya dişi, 1.5-2.5 ay, 20-25 g) ketamin (17.2 mg / mL), ksilazin (0.475 mg / mL) ve asepromazin (0.238 mg / mL) (6 μL / g vücut ağırlığı) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu (i.p.) ile uyuşturun. Hayvan ayak parmağı çimdikleme uyaranına yanıt vermeyi bıraktığında ve kornea refleksi olmadığında uygun anestezi derinliğine ulaşılana kadar bekleyin. Ameliyat sırasında, orijinal anestezik durumu korumak için gerektiği gibi anestezik kokteylin orijinal dozunun 1 / 3'ü kadar bir rapel doz verin.
3. Ameliyattan önce analjezik ajan olarak buprenorfini deri altına (s.c.; 0.05–0.10 mg / kg) enjekte edin. Kornea kurumasını ve katarakt oluşumunu önlemek için hayvanın gözlerine koruyucu merhem sürün.
4. Hipotermiyi önlemek için bir GCaMP6s transgenik fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin ve steril bir cerrahi örtü ile örtün. Fareler için bir Baş Tutma Adaptörü ile hayvanın kafasını sabitleyin.
5. Çift kenarlı bir tıraş bıçağıyla kafa derisinin çoğunun başını tıraş edin. Cerrahi alanı steril bir alkol hazırlama pedi ve ardından bir povidon-iyot çözeltisi ile temizleyin.

2. Kronik Kranial Pencere Hazırlığı

1. Kafatasının bir tarafında (sağda) bir makasla kafa derisini (2 mm x 3 mm) dikdörtgen bir şekilde kesin. >3 mm çapında bir pozlama alanı oluşturmak için cildi pamuklu çubukla kenara itin (Şekil 1A). Kafatasını künt bir mikrocerrahi bıçakla nazikçe kazıyarak kafatasına bağlı bağ dokusunu çıkarın (Neşter Bıçağı #10; Şekil 1C).
2. Bir diş matkabı kullanarak kafatası üzerine hafifçe bir daire (3 mm çapında, merkez koordinasyonu: bregmadan -1,5 mm ve orta hattan 2,5 mm) çizerek S1 alanını işaretleyin (Şekil 2B).
3. Aynı işlemi sol kafatasında da uygulayın (Şekil 2B).
4. Diş çimentosu uygulaması için bir temel sağlamak üzere kemiğe ince bir tabaka Siyanoakrilat Süper Yapıştırıcı uygulayın.
5. Diseksiyon mikroskobu altında, yüksek hızlı bir mikro matkap kullanarak kafatasında S1 alanı etrafındaki dairesel bir oluğu inceltin (Şekil 1D). Amaç, üzerine optik bir pencere yerleştirmek için pürüzsüz bir kenar oluşturmaktır.
6. Delme işlemini kolaylaştırmak ve ısıyı dağıtmak için inceltme işlemi sırasında kafatasına periyodik olarak tekrar tekrar yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF, oda sıcaklığı) uygulayın. Sürtünme kaynaklı aşırı ısınmayı önlemek için delme işlemini aralıklı olarak gerçekleştirin. Kemik kalıntılarını bir ev vakum hattı veya bir vakum pompası ile emdirin.
7. Kemiğin yaklaşık 2/3 derinliği delindikten sonra, kalan 1/3 kemik, kafatasının dairesel bir parçası (kemik flebi) çevredeki kafatasından tamamen serbest kalana kadar yavaş ve dikkatli bir şekilde inceltin.
8. Dairesel kemik flebini bir çift # 5/45 forseps ile yavaşça ve dikkatlice çıkarın ve durayı açığa çıkarın (Şekil 2C; Şekil 1E).
9. Açıkta kalan beyin bölgesini ACSF ile nemli tutun (Şekil 1E). Kanama beyin kan akışını değiştireceği, beyin şişmesini hızlandıracağı ve görüntüleme kalitesini ciddi şekilde düşüreceği için piyal damarlara herhangi bir zarar vermekten kaçının.
10. Aynı işlemi kafatasının sol (kontralateral) tarafında da uygulayın.
11. Optik pencereyi monte etmek için, kapak camı katmanları arasında birer birer yapıştırmak ve sertleştirmek için optik yapıştırıcı kullanın. Gerekirse, yapışkan yapışmayı güçlendirmek için optik pencereyi (12 saat boyunca 50 °C) bir inkübatörde ısıtın. Optik pencere 2 porsiyon içerir: üst kısım 5 mm çapında tek bir yuvarlak kapak camı içerir ve alt kısım 3 mm çapında 1-3 yuvarlak kapak camı içerir (Şekil 2D).
12. Optik pencereyi etanolde (%70, hacim/hacim) saklayın ve kullanmadan önce steril tuzlu su ile durulayın. Optik pencereyi kurmadan önce, yanlış miktarda optik yapıştırıcı veya stereoskop altında yanlış hizalama dahil olmak üzere optik pencerede kusurlar olup olmadığını kontrol edin.
13. Optik pencereyi kraniyotomi bölgesinin üzerine takın (Şekil 2D). Optik pencerenin üst kısmı kafatasına dayanır ve optik pencerenin alt kısmı kraniyotomize açıklığa sığar ve BOS varlığında dura dayanır (Şekil 2D, E).
14. Optik pencere kenarının üst kısmını Siyanoakrilat Süper Yapıştırıcı ile kafatasına kapatın (Şekil 2F; Şekil 1F).
15. Siyanoakrilat Süper Yapıştırıcı kuruduğunda, cam kenarını kaplamak için siyah diş çimentosu (Dentsply) uygulayın. Işığı engellemek için açıkta kalan tüm kafatası ve yara kenarlarına diş çimentosu uygulayın (Şekil 2G-H; Şekil 1B).
16. Aynı işlemi sol tarafta da gerçekleştirin.
17. Hayvanın ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin ve uygun izleme altında iyileşmesi için hayvanı ev kafesine geri koyun. Çiğnemeyi ve hidrasyonu kolaylaştırmak için ıslak yiyecekler sağlayın. Ağrıyı azaltmak için, 2 gün boyunca yaralanma sonrası her 8-12 saatte bir buprenorfin sc (0.05-2.0 mg / kg) uygulayın. Görüntülemeden önce farenin 7-10 gün daha iyileşmesine izin verin.

Sonuçlar

Şekil 1. Kafatası üzerinde iki taraflı pencerelerin oluşturulması. (A) Fotoğrafik bir görüntü, kafatasının her iki yanında S1 alanını kaplayan 2 kraniyal optik pencere gösterir. (B) Görüntünün kutulu bölgesinin yüksek büyütmesi (A) altta yatan dura ve kan damarlarını açığa çıkaran iki taraflı optik pencereleri gösterir. Ölçek çubuğu = 680 μm. (C) Açıkta kalan kafatası. (D) Merkezi bir kemik flebinin g...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL / 6J-TG (Thy1-GCaMP6s) GP4.3Dkim / J	Jackson	24275	Korteksteki uyarıcı nöronların alt kümelerinde yeşil floresan kalsiyum indikatörü GCaMP'yi eksprese eden genetik olarak kodlanmış nöronal gösterge ve efektör tarafından yapılan herhangi bir suş olabilir.
B6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Korteksteki belirli popülasyonlardaki nöronların alt kümelerinde EGFP'yi ifade eden herhangi bir suş olabilir; parlak, hayati bir Golgi benzeri leke sağlar.
Dumont no. 5 forseps, standart, Dumoxel	Güzel Bilim Araçları	11251-30	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Dumont no. 5SF forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-00	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Mikro Boncuk Sterilizatörü	Güney Laboratuvar Gereçleri	B1201	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Harishige'in SG-4N Baş Tutma Adaptörü	Tritech Araştırma	SG-4N Serisi	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
İdeal Mikro Matkap Komple Kiti	Harvard Aygıtı	72-6065	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Mikro Matkap için Çapaklar	Güzel Bilim Araçları	Lig 19007-05	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Yuvarlak kapak camı, 3 mm	Harvard Biyoloji Bilimleri	W4 64-0720	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Yuvarlak kapak camı, 5 mm	Harvard Biyoloji Bilimleri	W4 64-0700	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Norland optik yapıştırıcı	Norland Ürünleri	7106	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Loctite sıvı süper yapıştırıcı	Dünya Bankası Mason	LOC1647358	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Kavrama çimento kiti, toz ve solvent	Diş Çiçeği	675570	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir. 5 parça beyaz diş çimentosu tozunu (Kavrama Çimentosu) bir parça siyah Tempera toz boya ile karıştırın (ışıktan korumak için; bazı kullanıcılar 10:1 oranını tercih eder).
Jel köpük	Moore Tıbbi	2928	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Mikro diseksiyon makası	Roboz Belediyesi	RS-5841	Tercih edilen herhangi bir marka olabilir.
Yapay beyin omurilik sıvısı (ASF)	-	-	ACSF, 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 ve 20 mM glikoz içerir. ACSF'yi oksijenle (% 95 oksijen,% 5 karbondioksit) köpürtün ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Her deneyden önce taze ACSF çözeltisi hazırlayın.

Serisi Serisi Serisi