Bir omurilik diliminin substantia jelatinosa nöronunda tam hücre yama kelepçesi kaydı

Özet

Kaynak: Zhu, M., et al. Substantia Gelatinosa Nöronlarında Tam Hücre Yama Kelepçesi Kaydı için Akut Omurilik Dilimlerinin Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, nöron ateşleme modellerini analiz etmek için tam hücre yama-klemp tekniklerini kullanarak omurilik dilimlerinin substantia gelatinosa (SG) nöronlarında elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, omuriliğin SG nöronlarındaki uyaranlara verilen sinirsel tepkilerin incelenmesine izin verir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik incelemesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Çözelti ve Malzemelerin Hazırlanması

1. Çözümleri
   1. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın (mM cinsinden): 117 sodyum klorür (NaCl), 3.6 potasyum klorür (KCl), 1.2 sodyum dihidrojen fosfat dihidrat (NaH₂PO₄ · 2H₂O), 2.5 kalsiyum klorür dihidrat (CaCl₂ · 2H₂O), 1.2 magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl₂ · 6H₂O), 25 sodyum bikarbonat (NaHCO₃), 11 D-glikoz, 0.4 askorbik asit, ve 2 sodyum piruvat. Tablo 1'e bakın.
   2. K ⁺ bazlı hücre içi çözelti hazırlayın (mM cinsinden): 130 K-glukonat, 5 KCl, 10 Na 2-fosfokreatin, 0.5 etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N ", N" tetraasetik asit (EGTA), 10 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 4 magnezyum adenosin trifosfat (Mg-ATP) ve 0.3 lityum guanozin trifosfat (Li-GTP). Tablo 2'ye bakın.
   3. Sezyum (Cs ⁺) bazlı hücre içi çözelti hazırlayın (mM cinsinden): 92 sezyum metan sülfonat (CsMeS04), 43 sezyum klorür (CsCl), 10 Na_{2-fosfokreatin}, 5 tetraetilamonyum (TEA) -Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP ve 0.3 Li-GTP. Bkz. Tablo 3.
      not: Tüm çözeltiler damıtılmış su kullanılarak hazırlanmalıdır. ACSF ve sükroz-ACSF, yaklaşık 7.4'lük bir optimal pH'ı korumak için kullanımdan önce karbojene edilmelidir (% 95 O₂ ve% 5 CO₂ karışımı) ve bu iki çözeltinin ozmolalitesi 300-310 miliosmol (mOsm) olarak ayarlanmalıdır. Askorbik asit kalsiyum kanallarını etkileyebileceğinden, kalsiyum akımlarını kaydetmek isteniyorsa bu ajan çıkarılmalıdır. Hücre içi çözeltilerin ozmolalitesi ve pH'ı ölçülmeli ve sırasıyla 290-300 mOsm ve 7.2-7.3'e ayarlanmalıdır. Hücre içi solüsyonların 0.2 μm filtrelerle filtrelenmesi ve solüsyonların -20 °C'de 1 mL alikotlar halinde saklanması önerilir. Potasyum kanalını bloke etmek için ^{Cs +} ve TEA, inhibitör postsinaptik akımları (IPSC'ler) kaydederken membran potansiyelini 0 mV'de sabit tutmak için amplifikatörün kullanılmasına elverişli olan Cs + bazlı hücre içi çözelti içinde uygulanır.
2. Alet -leri
   1. Tipik bir elektrofizyolojik sistem için, kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) ve yüksek çözünürlüklü suya daldırma objektifi ile donatılmış dik bir mikroskop, bir CCD/CMOS kamera, bir yama kelepçesi amplifikatörü, bir mikropipet tutucu ve pipet konumunun hassas bir şekilde ayarlanmasına izin veren bir mikromanipülatör kullanın. Mikroskobu hareket ettirmek için bir XY aşaması da gereklidir.
   2. Tüm ekipmanı bir Faraday kafesi ile çevrili bir titreşim izolasyon masasına monte edin. Nöronları gözlemlemek ve mikropipetleri görselleştirmek için video kameraya bir video monitörü bağlayın.
3. Mikropipetler
   1. Bir mikropipet çektirme kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan kayıt elektrotları yapın. Tipik pipet direnci, hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 3-6 MΩ arasında değişir.

2. Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları

1. Substantia gelatinosa (SG) nöronlarından tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını yapmak için, çoğu kayıt durumu için K ⁺ bazlı hücre içi çözelti kullanırken, yalnızca inhibitör postsinaptik akımların kaydı için Cs ⁺ bazlı çözelti uygulayın.
2. Bir omurilik dilimini nazikçe kayıt odasına taşıyın ve ardından optimum dilim stabilitesi için naylon ipliklerle sıkıca tutturulmuş U şeklinde bir platin tel ile koruyun. Dilimi bir yerçekimi sistemi aracılığıyla RT'de kabarcıklı ACSF ile sabit bir şekilde perfüze edin ve yeterli oksijenasyonu elde etmek için perfüzyon hızını 2-4 mL / dk'ya ayarlayın.
3. Düşük çözünürlüklü bir mikroskop lensi kullanarak SG bölgesini (yarı saydam bir bant) tanımlayın, hedef hücre olarak yüksek çözünürlüklü objektifi kullanarak sağlıklı bir nöron seçin ve bunu video monitör ekranının merkezine ayarlayın.
4. Bir mikropipeti gerektiği gibi uygun hacimde K⁺ bazlı veya Cs⁺ bazlı hücre içi solüsyonla doldurun, mikropipeti elektrot tutucuya yerleştirin ve hücre içi solüsyonun tutucunun içindeki gümüş tele temas ettiğinden emin olun.
5. Mikropipeti odağa getirin, bir mikromanipülatör kullanarak ACSF'ye daldırın ve ardından mikropipeti herhangi bir kir ve kalıntıdan uzaklaştırmak için hafif bir pozitif basınç (manometre ile ölçüldüğünde ~1 psi) uygulayın.
6. Mikropipeti kademeli olarak hedeflenen nörona doğru hareket ettirin. Pipet nörona yaklaştığında pozitif basıncı serbest bırakın ve bir gigaseal oluşturmak için nöronal zar üzerinde çok küçük bir çukur oluşur.
7. Tutma potansiyelini, bir hücrenin fizyolojik dinlenme zarı potansiyeline (RMP) yakın olan -70 mV'a değiştirin. Ardından, zarı yırtmak ve iyi bir tam hücre konfigürasyonu oluşturmak için mikropipete geçici ve yumuşak bir emme uygulayın.
   not: Dilimi kayıt odasına aktardıktan sonra, dilim yüzeyindeki kalıntıları temizlemek için en az 5 dakika boyunca sabit perfüzyon sağlayın. Sağlıklı ve sağlıksız/ölü nöronları ayırt etme yeteneğinin, iyi sızdırmazlık ve kararlı kayıt için büyük önem taşıdığını belirtmekte fayda var. Sağlıksız/ölü bir nöron, görünür büyük bir çekirdekle birlikte şişmiş veya küçülmüş bir görünüme sahipken, sağlıklı bir nöron, parlak ve pürüzsüz bir zara sahip 3 boyutlu (3D) bir şekil ile karakterize edilir ve çekirdeği görünmezdir. Tüm hücre konfigürasyonunu elde etmek için, gerektiğinde hızlı veya yavaş kapasitansı adım adım telafi etmek önemlidir. Oda sıcaklığında (RT), sıvı bağlantı potansiyeli, K⁺ bazlı ve Cs⁺ bazlı hücre içi çözeltilerde sırasıyla 15.1–15.2 milivolt (mV) ve 4.3–4.4 mV olarak hesaplanır. Çalışmalarımızda, kaydedilen veriler sıvı bağlantı potansiyeli için düzeltilmemiştir.
8. İçsel membran özelliklerinin kayıtları
   1. Kayıt ateşleme özellikleri: RMP'de bir dizi 1 s depolarize edici akım darbesi (25 pA artışla 150-25 pikoamper (pA)) ile akım kelepçesindeki her bir nöronun ateşleme modelini test edin. Tek bir eylem potansiyelinin eşiğini, genliğini ve yarı genişliğini çevrimdışı olarak ölçün.

Tablo 1: ACSF Tarifi

parça	Molekül Ağırlığı	Konsantrasyon (mM)	g/L
NaCl (Doğal)	58,5	117	6,84
Kartal	74,5	3.6	0,27
NaH2PO4·2H2O	156	1.2	0,19
CaCl2·2H2O	147	2,5	0,37
MgCl2·6H2O	203	1.2	0,24
NaHCO3	84	25	2.1
D-Glikoz	180	11	1,98
Askorbik asit	198,11	0,4	0,08
Sodyum piruvat	110	2	0,22

Tablo 2: K⁺ bazlı hücre içi çözelti tarifi

parça	Molekül Ağırlığı	Konsantrasyon (mM)	mg/100 mL
K-glukonat	234,2	130	3044.6
Kartal	74,5	5	37,28
Na2-Fosfokreatin	453,38	10	453,38
EGTA (EGTA)	380,35	0,5	Saat 19.02
HEPES ÜNİVERSİTESİ	238,31	10	238,3
Mg-ATP	507,18	4	202,9
Li-GTP (Çelik)	523,18	0,3	15,7

Tablo 3: ^{Cs +} tabanlı hücre içi çözelti tarifi

)

parça	Molekül Ağırlığı	Konsantrasyon (mM)	mg/100 mL
CsMeSO4	228	92	2097.6
CsCl (İngilizce	168,36	43	723,95
Na2-Fosfokreatin	453,38	10	453,38
ÇAY-CL	165,71	5	82,86
EGTA (EGTA)	380,35	0,5	Saat 19.02
HEPES ÜNİVERSİTESİ	238,31	10	238,3
Mg-ATP	507,18	4	202,9
Li-GTP (Çelik)	523,18	0,3	15,7

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NaCl (Doğal)	Sigma	S7653 Serisi	ACSF ve PBS'nin hazırlanması için kullanılır
Kartal	Sigma	60130	ACSF, sükroz-ACSF ve K + bazlı hücre içi çözeltinin hazırlanmasında kullanılır
NaH2PO4·2H2O	Sigma	71500	ACSF, sakaroz-ACSF ve PBS'nin hazırlanmasında kullanılır
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080	ACSF ve sükroz-ACSF'nin hazırlanmasında kullanılır
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670	ACSF ve sükroz-ACSF'nin hazırlanmasında kullanılır
NaHCO3	Sigma	S5761 Serisi	ACSF ve sükroz-ACSF'nin hazırlanmasında kullanılır
D-Glikoz	Sigma	G7021	ACSF'nin hazırlanması için kullanılır
Askorbik asit	Sigma	P5280 Serisi	ACSF ve sükroz-ACSF'nin hazırlanmasında kullanılır
Sodyum piruvat	Sigma	A7631	ACSF ve sükroz-ACSF'nin hazırlanmasında kullanılır
Sakaroz	Sigma	S7903 Serisi	Sükroz-ACSF'nin hazırlanmasında kullanılır
K-glukonat	Wako (Vahşi)	169-11835	K + bazlı hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
Na2-Fosfokreatin	Sigma	P1937 Serisi	Hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
EGTA (EGTA)	Sigma	E3889	Hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H4034	Hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
Mg-ATP	Sigma	A9187	Hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
Li-GTP (Çelik)	Sigma	G5884	Hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
CsMeSO4	Sigma	C1426	Cs + bazlı hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
CsCl (İngilizce	Sigma	C3011	Cs + bazlı hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
ÇAY-CL	Sigma	T2265	Cs + bazlı hücre içi çözeltinin hazırlanması için kullanılır
Na2HPO4	Hengxing Kimyasal Reaktifleri		PBS'nin hazırlanması için kullanılır
Borosilikat cam kılcal damarlar	Dünya Hassas Aletler	TW150F-4	1,5 mm Dış Çap, 1,12 mm İç Çap
Mikropipet çektirme	Sutter Enstrümanı	P-97	Mikropipetlerin hazırlanmasında kullanılır
Kızılötesi CCD kamera	Dage-MIT	IR-1000
Yama kelepçesi amplifikatörü	HEKA (Türkçe	EPC-10
Mikromanipülatör	Sutter Enstrümanı	MP-285
XY aşaması	Burleigh	CEBELITARIK X-Y
Dik mikroskop	Olympus	BX51WI
Ozmometre	ileri	FISKE 210
PH metre	Mettler Toledo	FE20

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi ) Serisi Serisi Serisi Uçağı Serisi ) Serisi Serisi Dersi Serisi