Çok Şaftlı Lineer Silikon Problar Kullanılarak Davranan Farelerde Beyin Elektriksel Aktivitesinin Kaydedilmesi

Abstract

Kaynak: Sauer, J., et al. Davranan Farelerin Hipokampusunda Uzamsal Olarak Kısıtlı Salınımların Kaydedilmesi. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, yerel alan potansiyellerini ölçmek için fare beynine çok uçlu bir lineer silikon prob implante etmek için bir protokolü özetlemektedir. Prosedür, probun stereotaksik bir üniteye sabitlenmesini, hedef beyin bölgesi üzerinde doğru bir şekilde konumlandırılmasını, beyne yerleştirilmesini ve diş çimentosu ile sabitlenmesini içerir. İmplantasyondan sonra, montaj bir kılıf ile korunur. İyileşmeyi takiben, kurulum, nöronal aktivite hakkında bilgi sağlayarak yerel alan potansiyellerinin kaydedilmesine izin verir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hazırlıklar

1. İmplantasyon işlemi sırasında silikon probu ve elektrot konektörünü geçici olarak taşıyan uygun bir yerleştirme aleti tasarlayın ve oluşturun. Örnek bir özel yapım ekleme aracı için Şekil 1'e bakın.
2. Seramik uçlu forseps kullanarak silikon probu ve elektrot konektörünü ambalajından dikkatlice çıkarın.
3. Konektör kartını kaldırın ve bir standa bağlı bir timsah kelepçesi ile güvenli bir şekilde sabitleyin.
4. Bir stereoskop kullanarak, probu seramik uçlu forsepsli yerleştirme aletiyle hizalayın. Probu yerleştirme aletine yapıştırmak için bir koterizatör ile eritilmiş ~2 mm'lik bir parafin mumu tabakası uygulayın. Bu işlem sırasında prob şaftlarına dokunmamaya dikkat edin.
5. Elektrot konektörünü standart yapışkan bant kullanarak yerleştirme aletinin miline sabitleyin. Üreticiye bağlı olarak, implantasyondan önce topraklama kablolarının elektrot konektör kartına lehimlenmesi gerekebileceğini unutmayın. Bir havya (400 °C) ile uygulanan kalay lehim kullanarak iki kısa vernik yalıtımlı bakır tel parçasından yalıtımı çıkarın. Topraklama kablolarını elektrot konektör kartındaki uygun yuvalara lehimleyin.
6. İki ek bakır tel parçasının yalıtımını çıkarın. Her çıplak bakır teli paslanmaz çelik bir vidanın (1 mm çap, 2 mm uzunluk) etrafına üç kez sarın. Çelik lehimlemek için uygun akı uygulayın ve bakır teli vidalı kapağın altına lehimleyin. Vida dişinin alt yarısının kalay lehimi içermediğinden emin olun.
7. Tel ve vida arasındaki elektrik temasını kontrol etmek için standart bir multimetre kullanın.
8. Silikon probun saplarını ve topraklama vidalarını% 70 etanole (10 s) batırarak dezenfekte edin.
9. Plastik bir Pasteur pipetinin kafasını ikiye bölerek prob implantı için koruyucu bir kapak hazırlayın.

2. İmplantasyon Cerrahisi

1. Cerrahi aletleri (makas, ince uçlu forsepsler, cerrahi kelepçeler) sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize edin. Tüm yüzeyleri %70 etanol ile silin.
2. ~ 1 L / dk'da verilen oksijende% 3 izofluran ile anesteziyi indükleyin.
   1. Bakım için% 1 - 1.5 izofluran kullanın. Cerrahi tolerans elde etmek için gereken izofluran konsantrasyonunun hayvandan hayvana değişebileceğini unutmayın.
   2. Hayvan ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt vermediğinde stabil cerrahi tolerans elde edilir. Farenin solunum hızını izleyin ve gerekirse izofluran konsantrasyonunu ayarlayın.
   3. Kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine merhem sürün.
3. Kulak bantlarını kulak kanalına nazikçe yerleştirerek fareyi stereotaksik bir çerçeveye monte edin. Farenin başı kulak çubukları tarafından stabilize edildikten sonra, sürekli izofluran iletimi için burnun üzerine bir ağızlık yerleştirin. Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine havlu veya ped üzerine yerleştirin ve postoperatif analjeziyi sağlamak için deri altına (0.05 - 0.1 mg / kg vücut ağırlığı) buprenorfin enjekte edin.
4. Başınızı standart bir tıraş makinesiyle tıraş edin ve cildi %70 etanol ile dezenfekte edin. Cerrahi makas kullanarak, kafatasının orta hattı boyunca cilde bir kesi yapın ve cerrahi kelepçeler kullanarak cildi açın.
5. Bregma ve lambda'yı düzleştirmek için hayvanın başını stereotaksik bir hizalama aleti yardımıyla hizalayın. Bregma ve lambda arasında 50 μm'den daha az yükseklik farkı olmalıdır. Ayrıca, kafatası yüzeyindeki bregma derinliğini sol ve sağ belirli mesafelerde (örneğin, bregmanın 1 mm solu ve sağında) ölçerek başı mediolateral eksen boyunca düzleştirin. Gerekirse başın eğimini ayarlayın.
6. Kafayı% 3 hidrojen peroksit ile temizleyin ve steril pamuklu mendillerle kurulayın.
7. Uygun bir stereotaksik atlas kullanarak kraniyotominin bregmaya göre yerini belirleyin.
8. 0.9 mm'lik bir matkap kafası kullanarak, topraklama ve referans vidalarını yerleştirmek için beyincik üzerindeki kemikte iki vida deliği açın. Ek olarak, implantı stabilize etmek için sabitleme vidaları için 1-3 delik arzu edilir. Ankraj vidalarının yeri, kraniyotominin konumuna bağlı olacaktır. Hipokampus içine implantasyon için, kontralateral parietal ve ipsilateral frontal korteks üzerine ankraj vidaları yerleştirin. Uygun bir tornavida kullanarak vidaları kemiğe yerleştirin. Beynin içine girmemeye özen gösterin.
9. Kraniyotomiyi, implantasyon tarafının etrafındaki dikdörtgen bir alanda matkapla kafatasını yavaşça incelterek gerçekleştirin. Kemiği sık sık sterilize fosfat tamponu (PB) ile nemlendirin. Kalan incelmiş kafatası, ince (27G) bir enjeksiyon iğnesi ve bir cımbız yardımıyla nazikçe delinebilir ve çıkarılabilir.
10. Dura mater'i ince (27G) bir enjeksiyon iğnesi ile dikkatlice delin. İğnenin ucunu bir cımbızla bükerek küçük bir kanca oluşturun ve çıkarmak için durayı çekin. Beyin yüzeyinin kurumasını önlemek için PB uygulayın.
11. Elektrot yerleştirme aletini stereotaksik bir tutucuya monte edin, probu bregma üzerinde sıfırlayın ve probu kraniotomi üzerindeki stereotaksik koordinatlara getirin. Yavaşça beyin yüzeyine nüfuz eder. Prob millerinin bükülmediğinden emin olun. Kan damarları yoluyla implantasyon yapmaktan kaçının.
12. İstenilen derinliğin ~200 μm üzerine çıkana kadar probu yavaşça indirin. Koruma için silikon probun kraniyotomisini ve saplarını sterilize edilmiş Vazelin ile örtün. Probun tabanını kafatasındaki sabitleme vidasına sabitlemek için diş çimentosu uygulayın.
13. Çimento uygulamasından hemen sonra, probu yavaşça hedef derinliğe hareket ettirin. Çimentonun uygulanmasından sonra son ~ 200 μm'nin ilerletilmesi, probun yanal hareketini azaltır ve hedef alanda minimum doku hasarı sağlar. Kullanılan çimentonun kürlenme süresinin protokolün bu adımını etkileyebileceğini unutmayın. Hızlı kürlenen çimento ile bu adımı atlayın ve silikon probun hasar görmesini önlemek için probu doğrudan hedef derinliğe implante edin.
14. Çimento sertleştikten sonra, mumu bir koterizatör ile eriterek probu yerleştirme aletinden serbest bırakın.
15. Konektör kartını yerleştirme cihazından ayırın ve yerleştirme koluna takılı bir timsah kelepçesi kullanarak kafatası üzerinde uygun bir yere yerleştirin. Hipokampus içine prob implantasyonu durumunda, konektör kartını kontralateral parietal kemik üzerine yerleştirin. Konektör kartını diş çimentosu kullanarak kafatasına sabitleyin.
16. Konektör kartının topraklama ve referans kablolarını beyincik üzerindeki iki vidaya bağlı tellere lehimleyin.
17. Koruyucu kapağı doğru yüksekliğe kesin ve silikon probun üzerine yerleştirin. Açıkta kalan kafatasının etrafındaki deriden kaçınarak diş çimentosu kullanarak kapağı bağlantı kartına ve kafatasına sabitleyin. İmplantasyon bölgesinin etrafındaki cildin dikilmesi genellikle gerekli değildir.

3. Ameliyat Sonrası İyileşme

1. En az 2 gün boyunca uygun analjezik tedavi uygulayın (ör. gündüz her 6 saatte bir deri altı buprenorfin enjeksiyonları ve gece boyunca içme suyunda, her 24 saatte bir deri altından carprofen (4-5 mg / kg vücut ağırlığı) ile birlikte). İmplantın zarar görmesini önlemek için tek yuva önerilir.
2. İyileşme için en az bir hafta bekleyin. Yerel hayvan refahı yönergelerine danışın.

4. Veri Toplama

1. Bir komütatörle bağlanan uygun bir veri toplama sistemi kullanarak serbestçe hareket eden farelerden LFP'leri kaydedin. LFP'leri elde etmek için 1 - 5 kHz'lik bir örnekleme frekansı kullanın. LFP ile birlikte tek ünite deşarjlarının kaydedilmesi gerekiyorsa daha yüksek örnekleme hızları (20 - 30 kHz) gereklidir.
2. Çevrimdışı analiz için tek tek kanalların ham kayıt dosyalarını saklayın.

Results

Şekil 1: Yerleştirme aracının görüntüsü. Silikon prob, bir timsah kelepçesinin tabanına yapıştırılmış bir böcek pimine tutturulmuştur. Tutucunun şaftı, implantasyon için stereotaksik bir mikro manipülatöre yerleştirilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standlı timsah kelepçesi	Reichelt Elektronik	YULAR ZD-10D
Silikon probu	Cambridge Nöroteknoloji	P serisi 32
Stereoskop	Olympus	SZ51
Vernik yalıtımlı bakır tel	Bürklin Elektronik	89 F 232
Topraklama vidaları	Vidalar ve Daha Fazla GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
akı	Stannol Belediyesi	114018
Seramik uçlu forseps	Güzel Bilim Araçları	11210-60
Parafin Mumu	Sigma-Aldrich	327204
Koterizatör	Güzel Bilim Araçları	18010-00
havya	Kurtz Ersa	OIC1300
etanol	Carl Roth'un fotoğrafı	9065.1
Pasteur pipetleri	Carl Roth'un fotoğrafı	EA65.1
Isı sterilizatörü	Güzel Bilim Araçları	18000-45
Stereotaksik çerçeve	David Kopf ·	Model 1900
Stereotaksik elektrot tutucu	David Kopf ·	Model 1900
İzofluran	Kısaltma	B506
Oksijen konsantratörü	Solunum	1020007
Buprenorfin	Bireysel İngiltere Limited Şirketi
Elektrikli tıraş makinesi	Tondeo Belediyesi	Eko-XS
Isıtma yastığı	Termolüks	463265/-67
Cerrahi kelepçeler	Güzel Bilim Araçları	18050-28
Hidrojen peroksit	Sigma-Aldrich	H1009
Steril pamuklu mendil	Carl Roth'un fotoğrafı	EH12.1
alıştırma	Proxxon Teknolojisi	Mikromot 230/E
21G enjeksiyon iğnesi	B. Braun	4657527
Fosfat tamponu / fosfat tamponlu salin
Stereotaksik atlas	Elsevier	9.78E+12
Cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları	14094-11
Cerrahi forseps	Güzel Bilim Araçları	11272-40
27G enjeksiyon iğneleri	B. Braun	4657705
vazelin
Diş çimentosu	Güneş Medikal	Süper Tahvil T & M
Carprofen Teknolojisi	Zoetis Belediyesi	Rimadil 50mg / ml
Kayıt amplifikatörü	İntan Teknolojileri	C3323
USB toplama kartı	İntan Teknolojileri	C3004
Kayıt kabloları	İntan Teknolojileri	C3216
Elektrik komütatörü	Dor mercekler	İnsan Hakları Mahkemesi (HRJ-OE_FC_12_HARW