Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Deneysel Çözeltinin Hazırlanması
- Diseksiyon solüsyonunu gerçek deneyden 1 gün ila 1 hafta önce hazırlayın. Düşük sıcaklıklarda güçlü tamponlama kabiliyeti nedeniyle retina diseksiyonu için 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi kullanın16. Tüm kimyasalları aşağıdaki gibi karıştırın (mM cinsinden): 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glikoz. NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Solüsyonu 1 haftaya kadar buzdolabında saklayın.
- Kayıt çözümü, retina hazırlıkları için tasarlanmış yapay bir beyin omurilik sıvısı (aCSF) olan Ames'in ortamıdır. Deney gününe kadar, Ames'in tozunu (500 ml çözelti için 4.4 g) bir tüpte tartın. Ayrıca, NaHCO3'ü (500 ml çözelti için 0.95 g) tartın ve Ames tozu ile karıştırın.
- Deney gününe kadar yama kelepçesi kayıtları için hücre içi pipet çözeltisini hazırlayın. Tüm kimyasalları aşağıdaki gibi karıştırın (mM cinsinden): 111 K-glukonat, 1.0 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 10 NaCl, 1.0 MgCl2, 5 ATP-Mg ve 1.0 GTP-Na. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Pipet çözeltisini geleneksel bir şırınga filtresiyle filtreleyin. ~ 500 μl alikot yapın ve bunları bir dondurucuda veya derin dondurucuda saklayın.
2. Deney Gününe Hazırlık
- Deneyden önceki gece, bir fareyi bir kafese (C57BL / 6J veya benzer bir arka plan, 4 - 8 haftalık, erkek) gece boyunca (O / H) karanlık adaptasyon için karanlık bir alana yerleştirin.
- Diseksiyon için hazırlık:
- Diseksiyon solüsyonunu (100 - 200 ml) bir cam behere doldurun, buzun üzerine koyun ve en az 10 dakika oksijenle köpürtün.
- Retina hazırlığı depolaması için karanlık kutunun oksijenlenmesini başlatın.
- Retinal dilim hazırlıkları için yağ raylı plastik lameller hazırlayın ve her birini 35 mm'lik plastik bir tabağa koyun.
- Bir doğrayıcıya (doku dilimleyici) yeni bir tıraş bıçağı takın.
- Bir filtre membranını iki yarıya bölün. Bu retina dilimleme içindir.
- Diseksiyon aletlerini hizalayın ve pipetleri diseksiyon mikroskobunun yanına aktarın. Çalışma alanı, her bir alete karanlıkta kolayca erişilebilecek şekilde iyi organize edilmelidir.
- Yama kelepçesi kayıtları için hazırlık:
- Ames tozunu ve NaHCO3'ü damıtılmış suda çözün (Ames 4.4 g ve NaHCO3 0.95g / 500 ml ddH2O). Ames'in ortamını karışık oksijenle (%95O2 ve %5 CO2) en az 30 dakika köpürtün ve kayıt sıcaklığı seviyesine (~35 °C) ısıtın. Köpürmeye devam ederken NaHCO3 ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- Diseksiyon sırasında dahili pipet solüsyonunu çözün. Çözüldükten sonra, hücre içi boyama için% 0.01 sülforhodamin B ekleyin.
3. Retinal Dilim Hazırlığından Yama Kelepçesi Kayıtları
- Kayıt hazırlığı:
- Perfüzyon tüplerini Ames besiyeri ile astarlayın. Boruyu doldururken tüm kabarcıkların geçmesine izin verin.
- Bir çektirme ile yama kelepçesi kayıt pipetleri yapın. Bir pipeti pipet solüsyonuyla doldurmak için, pipet ucu geri dolana kadar pipetin arka tarafına 1 dakika batırın. Ardından, bir mikro pipet dolgusu kullanarak pipetin ~1/3'ünü doldurun. Her pipeti nemli bir pipet kutusunda saklayın.
- Bilgisayar, amplifikatör, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera ve mikroskop dahil olmak üzere yama kelepçesi kayıtları için ekipmanı açın.
- Oda ışığını kapatın. Kızılötesi görüntüleyici kullanarak mikroskop sahne odasına bir retina dilimi hazırlığı yerleştirin. İmmobilize olduktan sonra sürekli perfüzyona başlayın. Perfüzyon sıcaklığını 33 ila 37 °C arasında ayarlayın.
- CCD kamera ile dilim yüzeyini görüntüleyin. Hedef hücre tiplerinin bulunduğu hedef konuma odaklanın. Yama kelepçesi kaydı için sağlıklı görünen bir hücre seçin (yani, pürüzsüz görünümlü bir yüzeye ve iyi bir hücre şekline sahip olmalıdır).
- Pipet tutucusuna bir kayıt pipeti yerleştirin. Pipeti dilim hazırlığına ilerletin. Dilim hazırlığına yakın olduğunda (~2 mm yukarıda), mikroskopla pipetin ucunu bulun. Pipet ucu mikroskop altında göründüğünde, ucu hedef hücreye doğru aşağı doğru hareket ettirin.
- Amplifikatörü ayarlayın. Pipeti 0 mV/0 pA'ya (sıfırlama) ayarlayın ve ~5 Hz'de ~10 mV'luk sürekli bir elektrik darbesi başlatın. Pipet direncini kontrol edin; Çoğu retinal nöron için ideal direnç 5 ila 10 MΩ arasındadır.
- Uçtan dışarı üflemeye başlayın. Pipet banyo solüsyonuna daldırıldığında pozitif basınç uygulamak için bir ağızlık kullanın veya bir şırınga kullanın. Uç hedef hücrenin yüzeyine gelene kadar iç çözeltiyi sürekli olarak üfleyin.
- Pozitif basınç hücre yüzeyinde küçük bir çukur oluşturduğunda, ucu hafifçe ilerletin ve üflemeyi durdurun. Artması gereken pipet direncini kontrol edin. Sürekli artıyorsa, bırakın ve direnci >1 GΩ'a (gigaseal) ulaşana kadar izleyin. Direnç kendiliğinden artmazsa, gigaseal hale gelene kadar hafifçe negatif basınç uygulayın.
- Gigaseal elde edildikten sonra, tutma potansiyelini -70 mV olarak değiştirin. Ardından, pipet ucunun içindeki zarı yırtmak için aralıklı olarak negatif basınç uygulayın. Tüm hücre konfigürasyonu yapıldığında pipet direnci 500 MΩ ile 1 GΩ arasında olabilir ve kapasitif akım görülür. Bazen spontan postsinaptik akımlar gözlenebilir.
- -80 ila +40 mV arasında akım-voltaj (I-V) ilişkisini kaydedin. Hücre tipine bağlı olarak farklı tipte voltaj kapılı kanallar etkinleştirilir.
- Işıkla uyarılmış sinaptik akımları veya voltajları kaydedin.
