Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Transkardiyal perfüzyon
- 60 mL kapasiteli bir şırıngayı, tezgahın yaklaşık 18 inç üzerinde sükroz kesme çözeltisi için bir rezervuar olarak askıya alın (örneğin, dikey bir direk üzerinde üç uçlu bir döner kelepçe kullanarak). Boruyu rezervuarın dibine takın, boruyu bir silindir kelepçesinden geçirin ve borunun diğer ucunu temiz bir 20 G iğneye bağlayın.
- 60 mL rezervuarı yaklaşık 30 mL soğutulmuş sükroz çözeltisi ile doldurun ve perfüzatı sürekli olarak köpürtmek için sakaroz rezervuarına bir karbojen hattı yönlendirin.
not: Sükrozun borudan ve iğneden sıkışmış kabarcıklar olmadan aktığından emin olun. Akış hızı, iğneden sabit, sürekli bir damlayan sükroz akışına sahip olacak kadar hızlı olmalıdır.
- Bir blender kullanarak, donmuş sakarozları ezin ve buzlu bir bulamaç haline getirin ve bulamacı dağıtmak için büyük spatula / kaşık kullanın.
- Cam Petri kabı kapağının kenarlarına az miktarda sükroz bulamacı yerleştirin. Petri kabının dibine az miktarda sükroz bulamacı ekleyin.
- Perfüzyon sıvısı rezervuarına kabaca 20-30 mL sükroz bulamacı ekleyin, rezervuar çok soğuk, ağırlıklı olarak sıvı sükroz ve bir miktar donmuş çözelti karışımı içerene kadar 30 mL soğutulmuş sıvı sükroz ile iyice karıştırın.
- Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir odaya yerleştirin. Oksijen yaklaşık 2 L/dk'da akarken, %5 konsantrasyonda izofluran vermek için buharlaştırıcının kadranını çevirin ve bir zamanlayıcı başlatın.
not: Dilimlerin ne kadar hızlı elde edildiğini ölçmek için dilimleme boyunca bu zamanlayıcıyı açık tutun. Prosedür mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır, böylece dilimleme tamamlanmalıdır ve doku, hayvanın izofluran odasına girmesinden 15-20 dakika sonra arayüz odasında iyileşir. Derin bir anestezi durumuna ulaşıldığından emin olmak için fareyi izleyin. En az 5 dakika sonra, fare derin bir şekilde uyuşturulmalı ve ayak parmaklarının kıstırılmasına tepki vermemelidir.
- Fareyi izofluran odasından çıkarmadan hemen önce, Petri kabı kapağını yaklaşık 3-5 mm derinliğe kadar soğutulmuş sükroz çözeltisi ile doldurun ve Petri kabının tabanını yaklaşık 1.0 cm derinliğe kadar soğutulmuş sükroz çözeltisi ile doldurun.
- Fareyi hızlı bir şekilde sol emici pede aktarın ve ön ayakları ve kuyruğu sabitlemek için 3 parça bant kullanın. Herhangi bir kesi yapılmadan önce farenin yanıt vermediğinden emin olmak için arka ayak parmağını çimdikleyin. Büyük doku forsepsleri ve cerrahi makası kullanarak cildi örtün ve sternumun altından göğsün üstüne kadar uzunlamasına bir kesi yapın. Forsepsleri kullanarak sternumu yukarı çekin ve diyaframı kesmek için makası kullanın.
not: Farenin ilk konumlandırılması ve diyaframı kesmek için ilk birkaç kesi, farenin bilincini geri kazanmamasını sağlamak için mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Prosedür boyunca yeterli anestezi derinliğini sağlamak için, perfüzyon sırasında izofluran vermek için fareye bir burun konisi yerleştirilebilir.
- Her iki taraftaki göğüs kafesini kesmek için makası kullanın ve ön ayağın vücutla birleştiği noktaya doğru büyük bir hareketle kesin. Forseps ile göğüs kafesinin önünü uzağa ve başa doğru sallayın ve ardından büyük bir makas kullanarak yatay bir kesim ile tamamen çıkarın. Büyük forsepsleri kullanarak kalbi yerinde tutun ve 20 G perfüzyon iğnesini sol ventriküle yerleştirin. İğne doğru bir şekilde yerleştirildikten sonra, soğutulmuş sükroz çözeltisi ventrikülü doldururken kalbin sol tarafı hızla soluklaşmalıdır.
- Sağ atriyumu kesmek ve kanın dolaşım sisteminden dışarı akmasına izin vermek için küçük disektör makasını kullanın. Kesiler doğru yapılırsa, kalpte minimum hasar olmalı ve perfüzyon boyunca pompalamaya devam etmelidir.
not: Sarılmış kağıt mendil parçaları, kalpten kan ve sükroz solüsyonunu uzaklaştırmak ve işlem sırasında perfüzyon iğnesinin görünürlüğünü korumak için kullanılabilir.
- Perfüzyon iğnesinin yerinde kaldığından ve sol ventrikülden düşmediğinden emin olun. Uygun bir akış hızı ve yerleştirme ile karaciğer 20-30 s ile açık ten rengi / bej bir renge solmaya başlayacaktır.
- 30-45 saniye sonra, farenin kafasını kesmek için büyük makası kullanın. Kafayı sol elinizle tutarak, cildi kafatasından uzaklaştırın veya soyun. İyi perfüze edilmiş bir hayvanda, kafatası çok soluk olmalı ve beyin, açıkça görülebilen kan damarları olmadan kafatası boyunca çok açık pembe bir renk (beyaza yaklaşan) görünmelidir.
2. Beyni çıkarın ve dilimleri kesin
- Küçük Bonn makasını kullanarak, kafatasının ön tarafında, gözlerin yakınında, orta hatta doğru kafatasından iki yanal kesik yapın. Kafatasının tabanının her iki tarafında iki ek kesim yapın.
- Kafayı, çoğunlukla soğutulmuş sükroz çözeltisine daldırılması gereken cam Petri kabının dibine aktarın. Kafatasının uzunluğu boyunca orta çizgiyi kesmek için küçük Bonn makasını kullanın ve alttaki beyin dokusuna verilen zararı en aza indirmek için makasla yukarı çekin. Küçük doku forsepslerini kullanarak, kafatasının her iki tarafını sıkıca kavrayın ve bir kitap açar gibi beyinden yukarı ve uzağa doğru sallayın.
- Kafatasının kanatlarını açık tutmak için sol elin parmaklarını kullanın ve mikrospatulayı beynin altına koku alma ampullerinin yanına yerleştirin. Beyni kafatasından sakarozun içine çevirin ve beyin sapını kesmek için mikrospatulayı kullanın. Kalan kanı, kürkü veya diğer dokuları çıkarmak için beyni yıkayın.
- Beyni cam Petri kabının kapağına aktarmak için büyük spatula/kaşık kullanın. Çift kenarlı tıraş bıçağının diğer yarısı daha önce bir kenara bırakılmışken, önce beyinciği ve ardından koku soğancıkları da dahil olmak üzere beynin en ön kısmını çıkarmak için iki koronal kesi yapın (Şekil 1).
- Agar rampasına siyanoakrilat yapıştırıcı sürün. Beyni çok kısa bir süre için büyük doku forsepslerini kullanarak bir parça kuru filtre kağıdına yerleştirin ve ardından beynin ventral yüzeyini yapıştırıcının üzerine yerleştirerek hemen agar rampasına aktarın.
not: Orta hipokampus dilimleri için, beyin, ön kısım rampanın eğimine bakacak ve arka kısım bıçağa daha yakın olacak şekilde yönlendirilmelidir. Ventral hipokampus dilimleri için, beyni, ön ucu rampanın eğiminden aşağı bakacak şekilde, arka ucu rampanın tepesinde, bıçaktan daha uzakta olacak şekilde yönlendirin. Her iki durumda da, beyin, beynin koronal kesim yüzeyi agar destek bloğuna temas edecek şekilde rampanın tepesine yerleştirilmelidir (Şekil 1).
- Dilimleme platformunu agar ve beyin ile birlikte mikrotomun dilimleme odasına yerleştirin ve soğutulmuş sükroz çözeltisi ile tamamen daldırın. Bir miktar sakaroz bulamacını hazneye aktarmak için büyük spatula/kaşık kullanın, donmuş sakarozları eritmek için karıştırın ve karışımın sıcaklığını hızla ~ 1-2 ° C'ye düşürün.
not: Dilimleme boyunca sıcaklık göstergesine dikkat edin. Sükroz çözeltisi 3 °C'nin üzerinde ısınırsa, daha fazla bulamaç ekleyin ve sıcaklığı tekrar düşürmek için karıştırın.
- Mikrotom hızı 0,07 mm/sn'ye ayarlanmış olarak 450 μm kalınlığında dilimler kesin. Her dilim serbest kalırken, önce iki yarım küreyi ayırmak için küçük doku forsepsleri ve keskin bir neşter kullanın ve ardından dilim esas olarak hipokampus ve parahipokampal bölgelerden oluşana kadar dokuyu kesmek için kullanın (Şekil 1).
- Dilimleri ayrı ayrı arayüz geri kazanım odasına aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın ve dilimleri kaplayan yalnızca ince bir yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) menisküsü ile ACSF'nin ve havanın arayüzüne yerleştirildiklerinden emin olun. Haznenin kapağını sıkıca kapatın ve dilimlerin 32 °C'de 30 dakika boyunca toparlanmasına izin verin.
- 32 ° C'de ilk geri kazanımdan sonra, arayüz geri kazanım odasını su banyosundan çıkarın ve manyetik karıştırma çubuğu ACSF'nin oda içinde dolaşımını teşvik edecek şekilde yavaş bir hıza ayarlanmış bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Dilimler 90 dakika daha toparlanırken yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumasına izin verin. Geri kazanım odasının sürekli olarak karbojen ile köpürtüldüğünden emin olun ve büyük kabarcıkların dilimlerin altında sıkışmasına izin vermeyin.
3. Spontan aktivitenin yerel alan potansiyeli (LFP) kayıtlarını gerçekleştirin
- Edinme yazılımını çalıştıran bilgisayar, bilgisayara bağlı monitör, stimülatörler, mikromanipülatör, sıcaklık kontrol cihazı, mikroskop ışık kaynağı, mikroskoba bağlı kamera, mikroelektrot amplifikatörü, sayısallaştırıcı ve peristaltik pompa dahil olmak üzere gerekli tüm ekipmanı açarak LFP kayıtlarına hazırlanın. Merkezi bir vakum sistemi kullanıyorsanız, ACSF'yi kayıt odasından çıkaracak vakum hattını hazırlamak için duvar vanasını açın.
- Isıtılmış rezervuarı ACSF ile doldurun, ardından borunun bir ucunu köpüren ACSF'yi içeren 400 mL'lik behere yerleştirin. ACSF'yi 400 mL'lik beherden ısıtılmış rezervuara ve rezervuardan kayıt odasına yönlendirmek için peristaltik pompayı açın. Sıkışan baloncukları serbest bırakmak için boruya dokunun veya sıkıştırın.
- Kayıt odasından geçen ACSF akış hızının hızlı (~ 8–10 mL/dak) olduğundan emin olmak için peristaltik pompayı ayarlayın. ACSF'nin kayıt odasının merkezinde 32 °C olduğundan emin olmak için bir sıcaklık probu kullanın.
not: ACSF, peristaltik bir pompa kullanılarak kayıt odasına iletilirse, yüksek bir akış hızı, akış hızında önemli bir dalgalanmaya neden olabilir. Boruya entegre edilmiş bir dizi boş şırıngadan oluşan basit bir titreşim sönümleyici kullanılarak tutarlı akış hızları elde edilebilir (Şekil 2).
- Isıtılmış bir filament çektirme kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan stimülasyon ve kayıt pipetleri hazırlayın. Çektirme protokolü, stimülasyon veya yerel alan potansiyeli kayıt elektrotları için 2-3 MOhm dirençli pipetler verecek şekilde yapılandırılmalıdır.
- Stimülasyon pipetlerini 1 M NaCl ile ve LFP pipetlerini ACSF ile doldurun.
- Boruyu kısaca sıkıştırın ve ACSF akışını duraklatmak için pompayı kapatın. Dilimin üzerinde durduğu lens kağıdının bir köşesini kavramak için ince forseps kullanarak bir dilimi kayıt odasına aktarın - dilim lens kağıdına yapışacaktır. Lens kağıdını yerleştirin ve dilim aşağı bakacak şekilde kayıt odasına dilimleyin, ardından mercek kağıdını "soyun" ve dilimi kayıt odasına daldırın. Dilimi bir arp kullanarak sabitleyin.
not: Harplar, U şeklinde bir paslanmaz çelik parçası veya platin ve ince naylon filament kullanılarak önceden yapılmış veya laboratuvarda satın alınabilir.
- Manuel mikromanipülatöre NaCl dolgulu bir stimülasyon pipeti yerleştirin ve pipetin ucunu yaklaşık 30-45°'lik bir açıyla dilimin yüzeyine (örneğin stratum radiatum tabakasında) yavaşça ilerletin. Pipetin ucu dokuya girdikten sonra, pipeti yavaşça ileri doğru ilerletin ve dilim içindeki aksonlara gereksiz yere zarar verebilecek yanal veya dikey yönde büyük hareketlerden kaçının. Dilimleme sırasında zarar gören yüzeye yakın hücreleri önlemek için pipetin ucunu dilimin en az 50-100 μm derinliğine yerleştirin.
- Motorlu mikromanipülatöre bağlı pipet tutucuya ACSF dolgulu bir LFP pipeti yerleştirin. Ağız basıncı veya bir vana valfi ile bağlanan 1 mL'lik bir şırınga ve pipet tutucusuna kısa bir boru uzunluğu kullanarak çok hafif bir pozitif basınç uygulayın.
not: İlgilenilen sinyalleri kaydetmek için LFP pipetlerini dilim içine yerleştirin: keskin dalga dalgalanmaları durumunda, bir LFP pipeti stratum pyramidale'ye (SP) ve ikinci bir pipet stratum radiatum'a (SR) yerleştirilmelidir. Bu konfigürasyon, SR'deki negatif keskin dalganın ve SP'deki yüksek frekanslı dalgalanma salınımının aynı anda kaydedilmesine izin verir (Şekil 3).
- Mikromanipülatörü kullanarak, LFP pipetinin ucunu yaklaşık 30-45°'lik bir açıyla ilgilenilen bölgeye (örneğin CA1 piramidal hücre tabakası) yavaşça ilerletin. Dilimleme sırasında zarar gören yüzeye yakın hücreleri önlemek için pipetin ucunu dilimin en az 50-100 μm derinliğine yerleştirin. LFP pipetini ilerletirken, toplama yazılımını kullanarak sürekli olarak küçük bir voltaj test darbesi verin ve elektrot direncinde ani bir artış olup olmadığını izleyin. Bu, pipetin tıkandığını veya bir hücreye bastırıldığını gösterebilir.
- LFP pipeti ilgili bölgeye yerleştirildikten sonra, pipet tutucusuna bağlı hortum üzerindeki valfi açarak pozitif basıncı dikkatlice boşaltın.
- LFP'yi aynı anda ikinci bir konuma kaydetmek için ikinci bir pipet ve mikromanipülatör ile 6.8–6.10 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Pipetin seri direncini düzeltmek için toplama yazılımındaki köprü dengesi işlevini kullandıktan sonra yerel alan potansiyelindeki spontan aktiviteyi kaydetmek için akım kelepçesi konfigürasyonundaki mikroelektrot amplifikatörünü kullanın. Spontan keskin dalga dalgalanmaları (SWR'ler), SP tabakasının hücre dışı potansiyelinde pozitif sapmalar olarak görünecektir (Şekil 3).
- Uyarılmış alan potansiyellerini kaydetmek için, NaCl dolgulu stimülasyon pipetinden kısa (200 us) kare voltaj darbesi vermek için sayısallaştırıcıya bağlı stimülatörleri kullanın. Bir dizi tepki genliğini uyandırmak için stimülasyon voltajı kadranını ayarlayın.
