Fare kılı foliküllerinde mekanik olarak uyarılmış afferent çıktının ve sinir terminali etiketlemesinin birleşik kaydı

Özet

Kaynak: Bewick, G. et al., Fare Saç Folikülü Lanceolat Uçlarında Mekanik Olarak Uyarılan Afferent Çıktı ve Sinir Terminali Etiketlemesinin Birleştirilmiş Kaydı. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, bir fare kulak kepçesinin kıl foliküllerinde mekanik olarak uyarılmış afferent çıktı ve sinir terminali etiketlemesinin birleşik kaydını göstermektedir. Bir floresan membran boyasına maruz kalmadan önce ve sonra saç folikülü sinir terminallerinin mekanik stimülasyonu, üretilen aksiyon potansiyellerinin elektrofizyoloji kaydı ve saç foliküllerindeki sinir terminali etiketlemesinin görselleştirilmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Elektrofizyolojik Kayıt Kurulumu

1. Fare dış kulak (kulak kepçesi) derisini, kenarlarında ince böcek pimleri bulunan (kulak başına ~ 6-8) bir kayıt odasının PDMS kaplı tabanına sabitleyin, temizlenmiş sinirleri kulağın tabanına iki emme elektrodunun yanına yerleştirin - biri kayıt için (siniri almak için) ve diğeri kayıtsız bir elektrot (nötr sinyali bir diferansiyel amplifikatöre sağlamak için).
2. Kayıt elektrodu için, açıklığın açıklığı ve iç çapını iki sinirin birleşik kalınlığıyla dikkatlice eşleştirin, böylece mümkün olduğunca sıkı ve mümkün olduğunca uzun bir uzunlukta otururlar.
3. Diğer ucuna silikon kauçuk boru ile tutturulmuş 2 ml'lik bir şırıngadan hafifçe emerek sinirleri elektrotun içine çekin. Sinirlerin düz olduğundan, katlanmadığından veya ikiye katlanmadığından emin olun.
4. Sinirin etrafındaki açıklığı sıkıca kapatan bir tıkaç oluşturmak için bağ dokusu veya yağ dokusu çekmek için daha güçlü emme kullanarak yüksek bir elektrik direnci / empedans uyumu geliştirin.
5. Diğer (kayıtsız) elektrodu gerekirse emerek tuzlu su ile doldurun (kılcal hareket ile doldurulabilir).
6. Aynı kayıt tellerini (gümüş veya platin), tuzlu su ve elektrotun siniri (kayıt) veya elektrotun daralmış, ateşle parlatılmış ucu (kayıtsız) ile temas ettirmek için kayıt elektrotlarının iç deliğine yerleştirin. Her elektrot, iki damarlı ekranlı kablonun farklı damarlarına ayrı ayrı lehimlenir. Banyo (toprak) elektrodunu (Ag/AgCl peleti) banyoya yerleştirin ve kayıt elektrotlarına bağlı iki damarlı kablonun ekranına topraklayın.
7. İki elektrottan gelen elektriksel aktiviteyi bir diferansiyel amplifikatörün ayrı kanallarına besleyin, filtreleyin (bant geçiren 0.2-2 kHz) ve view bir osiloskop ekranında. Kanal A (kayıt) ve kanal B (kayıtsız) elektriksel gürültü seviyelerinin benzer göründüğünü kontrol edin. Bu aşamada, iki elektrot dengelenmeden önce kanal A'daki normal spontan aksiyon potansiyellerini görmek mümkün olmayabilir.
8. Kayıt (kanal A) veya kayıtsız (kanal B) elektrotların empedansını artırarak elektrotlar arasındaki arka plan gürültüsündeki farklılıkları giderin. Bunu, areolar (yağ) bağ dokusunu elektroda daha fazla emerek ve / veya 50 ml'lik şırıngaya daha fazla emme kuvveti uygulayarak yapın.
   1. Bu şekilde 'dengelendikten' sonra, diferansiyel (AB) kayda geri dönün ve izde veya kulak kepçesinin kenarındaki tüyleri okşarken spontan aksiyon potansiyellerini (AP'ler) arayın. Herhangi bir aktivite (sivri uç) görülmezse, kayıt elektrodundaki sinirin ve kayıtsız elektrottaki areolar bağ dokusunun sıkı oturduğunu yeniden kontrol edin - genellikle, conta ne kadar sıkı (daha yüksek direnç) ve iki elektrottaki empedans ne kadar eşitse o kadar iyidir. Pratik uygulama yapıldığında bu, iyi kalitede (>2:1) bir sinyal:noise oranı elde edecektir.
9. Elektronörogramı bir laboratuvar arayüzü ve bir bilgisayarda çalışan elektrofizyoloji yazılımı aracılığıyla kaydedin. Spiking'in bir ses çıkışı çok kullanışlıdır ve nörogramı bir ses amplifikatörü ve ilgili ses hoparlörü aracılığıyla besleyerek elde edilebilir. Eşiği, temel gürültünün hemen üzerinde olacak şekilde ayarlayın (beyaz gürültü 'tıslama' olmaması ile tanımlanır).
10. İlaç veya floresan stiril boyanın mızrak şeklinde uçlara erişimini artırmak için, kulak kepçesi kenarına yakın subdermal yağ tabakasını dikkatlice soyun, ~ 5 mm x 5 mm'lik bir pencere açın, dermisi ve foliküllerin tabanını açığa çıkarın (Şekil 1A, B).
11. Ön kenar boşluğunda (varsa, yeni üretilen pencere seviyesinde) ~ 1 mm'lik yağ temizlenmiş kulak derisinin bir katını geri sabitleyin ve uygulanan cilt katmanları arasında şeffaf bir tuzlu su dolu boşluk bırakın. Osiloskop üzerindeki maksimum AP çıkışı alanını ve ses çıkışındaki belirgin 'tıklamaları' ve 'patlamaları' bulmak için cilde dokunmadan katlanmış kenar boyunca çıkıntı yapan tüyleri bir pim veya topraklanmış ince forseps ile nazikçe okşayın.

2. Uyaranla Uyarılan Aksiyon Potansiyellerinin Kaydedilmesi

1. Mekanik stimülasyon probunu - seramik piezo-elektrik aktüatöre bağlı ateşle parlatılmış 10 cm borosilikat mikroelektrot camı - hareket cilt kıvrımına paralel olacak şekilde konumlandırın. Ucu cilt kıvrımından yaklaşık 0,5-1 mm uzağa yerleştirin, böylece tüylere temas eder ancak cilde temas etmez. Kılları saptırmak ve ani yükselmeyi gözlemlemek/dinlemek için prob ucunu manuel olarak yavaşça hareket ettirerek etkili stimülasyonu doğrulayın.
2. Yazılımı, 1-3 kıl telinin mekanik stimülasyonunu sağlamak için kullanın (, örneğin 5 Hz sinüzoidlerde 3 saniye, her 10 saniyede bir. Prob deplasmanı 200-500 μm) ve sinirlerdeki stimülasyonla uyarılan yanıtları kaydedin.
3. 10 saniye aralıklarla birkaç özdeş mekanik stimülasyon treni verin. Tekrarlanabilirlik için prob konumunu optimize edin, ardından deneysel protokole göre stimülasyon frekansını azaltın ( örn. tekrarlama hızını 10 saniyeden 30 saniyeye düşürün).
4. Yazılımı, AP benzeri etkinlikleri ayırt etmek için kullanın, örneğin, yüksek frekanslı gürültü genliğinin ~2 katı ve en büyük AP'lerin ~%25'i olarak ayarlanmış basit bir eşik kullanarak.
5. Eşiği geçen AP'leri 'olaylar' olarak sayın, üretilen AP'lerin sıklığını ve özelliklerini ölçün.

3. N- (3-trietilammoniumpropil) -4- (4- (dibutilamino) stiril) Piridinyum Dibromür Etiketleme ile Birleştirilmiş Uyaran Uyarılmış Ateşlemenin Kaydedilmesi

1. Stiril boyaların uyaranla uyarılmış afferent ateşleme ve terminal etiketleme üzerindeki etkilerini incelemek için, banyo çözeltisine uygun konsantrasyonda tercih edilen bir stiril boya ekleyin ve elektrik kaydına devam edin.
2. Gerekli maruz kalma süresinden sonra (genellikle en az 30 dakika), folikülleri görüntülemek için hazırlığı hazırlayın. Tutma pimlerini çıkararak cilt kanadını açın ve terminal etiketlemesini ortaya çıkarmak için temizlenmiş dermal alanı ortaya çıkarın.
3. Dış boyayı boyasız tuzlu su ile yıkayın ve 3 tam tuzlu su değişikliği yapın.
4. En kalıcı boya kontaminasyonunun açıkta kalan / dış membranlardan sızmasına izin vermek için gazlanmış boya içermeyen salinin son değişiminde 10-15 dakika inkübe edin.
5. Membranlar üzerinde kalan içselleştirilmemiş boyayı tuzlu su içinde bir kenetleme ajanı (sülfobutillenmiş beta-siklodekstrin, 1 mM, 5 dakika) ile çıkarın.
6. Kayıt odasını dik bir epifloresan mikroskobu aşamasına aktarın ve odayı aşama/slayt hareket mekanizması ile meşgul edin.
7. Preparatı stiril boyaya uygun uyarma ışığı ile aydınlatın. Folikül etiketlemesini gözlemlemek için 10X veya 25X floresan mikroskobu objektifi kullanın (Şekil 1).

Sonuçlar

Şekil 1: Elektrofizyolojik Kayıt Düzenlemesi ve Saç Folikülü Afferent Lanceolat Uçlarının N-(3-trietilammoniumpropil)-4-(4- (dibutilamino) stiril) Piridinyum Dibromür Etiketlemesi. (A) Yağ dokusu çıkarıldıktan sonra kulak kepçesi oryantasyonunu, sinirlerin yerini, kayıt elektrotlarını ve folikül innervasyonunun açıkta kalan alanını gösteren elektrofizyolojik bir deney için kurulmuş b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		Esnek, inert, yarı saydam katı silikon polimer.
No. 3 Dumont forseps	Güzel Bilim Araçları	11231-20
Austerlitz Böcek iğneleri	Güzel Bilim Araçları	26002-10	Kulak kepçesi preparatını minimum hasarla PDMS'ye güvenli bir şekilde takmak için çok ince pimler.
AC Diferansiyel Ön Yükseltici	Digitimer	Nörolog NL104A	Gelen afferent elektronörogramın boyutunun büyütülmesi. Diferansiyel kayıt, yabancı elektriksel gürültüyü ve taban çizgisi kaymasını en aza indirir.
Yüksek/Düşük Geçiren Filtre	Digitimer	Nörolog NL125	En iyi sinyal-gürültü oranını sağlamak için yabancı elektriksel gürültüyü azaltarak sinyal koşullandırma.
Ani Yükseliş Tetikleyici	Digitimer	Nörolog NL201	Olay algılayıcı eşiğini ayarlar ve osiloskopta görüntüler. Bu, aksiyon potansiyeli tespit etkinliğini gösterir.
Ses Yükseltici ve hoparlörler	Digitimer	Nörolog NL120S	Mikroskopta mekanik stimülasyon preparatını ayarlarken duyusal uçların elektriksel ateşlemesinin varlığı için faydalı ses izleme
Osiloskop	Digitimer	PM3380A	Bu eski modeli kullanıyoruz, ancak herhangi bir standart osiloskop yeterli olacaktır.
Piezo elektroseramik gofret	Morgan Electroceramics, Southampton, Birleşik Krallık	PZT507	Elektrofizyoloji/bilgisayar arayüzü
Piezo elektroseramik güç kaynağı	Ev yapımı		0-200V DC çıkış, kayıt / stimülasyon yazılımı ve bilgisayar arayüzü aracılığıyla çıkışın değişken elektronik kontrolü ile. Spike2 yazılımını ve 1401micro bilgisayar arayüzünü kullanıyoruz.
Elektrofizyoloji Yazılımı	Cambridge Elektronik Tasarımı (CED)	Spike2 v7	Elektrofizyoloji kayıt, stimülasyon ve veri analiz yazılımı
Laboratuvar arayüzü	Cambridge Elektronik Tasarımı (CED)	1401 mikro	Amplifikatör/filtreler ve bilgisayar arasında elektrofizyoloji arayüzü. Elektronörogramı girer ve aynı zamanda elektroseramik hareketi çalıştırır.
FM1-43/Sinaptoyeşil C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	Hücre zarlarının dış broşürüne geri dönüşümlü olarak ayrılan floresan membran probu. Ağırlıklı olarak vezikül membranı endo- / ekzositozu izlemek için kullanılır.
Advasep 7	Biotium/Cambridge Biyobilimi	BT70029	FM1-43'ü (ve diğer stiril piridinyum boyalarını) açıkta kalan zarlardan şelatlayan ve arka plan etiketlemesini / floresansını düşürerek içselleştirilmiş boyanın daha net görülmesini sağlayan sülfonatlı bir b-siklodekstrin türevi.
Retiga Exi Hızlı 1394	Qimaging		Tek renkli, soğutmalı CCD kamera - temel model
Volocity 3D Görüntü Analiz Yazılımı	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Görüntü yakalama ve analiz yazılımı.

Seramik gofret yer değiştirmesini sürmek için