$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Larva Drosophila CNS'yi İnceleyin ve Hazırlayın
>NOT: Larva CNS diseksiyonu için yöntemler Hafer ve Schedl'de açıkça gösterilmiştir, ancak daha önce yayınlanan bu yöntemler, spike frekansını ölçmek için önemli olan inen nöronların uzunluğunu azaltır. Burada, uzun, sağlam inen nöronları koruyan larva CNS'yi çıkarmak için ek bir yöntem özetlenmiştir.
- Tuzlu su hazırlama.
- Diseksiyon ve kayıt salinini mM cinsinden aşağıdakilere hazırlayın: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2 - [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES); pH'ı 7.25'e titre edin.
- Larva Drosophila CNS'yi inceleyin.
- Kültür şişesinden dolaşan bir üçüncü instar Drosophila melanogaster'i tanımlayın ve çıkarın ve 200 μL tuzlu suya yerleştirin (Şekil 1A).
- Ağız kancalarını bir çift ince forseps ile kavrayın ve ikinci bir çift forseps ile kurtçuğun karnını kavrayın (Şekil 1B).
not: Karın bölgesine çok fazla baskı uygulamayın çünkü bu, kurtçuğun ince kütiküler tabakasının yırtılmasına neden olabilir.
- Kurtçuğun kuyruk ucunu baş bölgesinden ayırmak ve kurtçuğun iç organlarını ortaya çıkarmak için ağız kancalarını ve karnı farklı yönlerde nazikçe çekin (Şekil 1C).
not: CNS, trakea ve sindirim sistemi ile iç içe olacaktır. İnen periferik sinirlerin kesilmesini önlemek için CNS'yi herhangi bir dokudan kesmeyin.
- CNS'yi sindirim sisteminden ve trakeadan forseps ile çıkarın (Şekil 1D).
- Gerekirse, Vannas yaylı makas ile CNS posteriorunu serebral loblara manuel olarak keserek kan beyin bariyerini bozun.
not: Bu, kullanılan kimyasalın fizyokimyasal özelliklerine göre yapılmalıdır. Şekil 2A'daki kırmızı çizgi, önerilen transeksiyon noktası ve Şekil 2B'de gösterilen sağlam inen periferik sinir gövdeleri ile kesilen CNS'dir. Kesilen CNS, adım 1.2.5'in tamamlanmasından sonra deney için hazırdır.
2. Drosophila CNS'nin hücre dışı kaydı.
- CNS'yi kayıt için hazırlayın.
- Borosilikat cam kılcal damarlardan 5-15 mΩ'luk bir dirence kadar bir cam pipet elektrodu çekin.
- Kesilen CNS'yi 200 μL salin içeren balmumu odasına yerleştirin. Kaplanmamış bir böcek pimini, topraklama kablosuna lehimlenmiş timsah klipsi ile sıkıştırın ve devreyi tamamlamak için pimi tuzlu suya yerleştirin.
- Mikromanipülatörleri kullanarak, elektrodu kesilen CNS'nin kaudal ucuna yönlendirin. Periferik sinir gövdelerine temas etmeden önce edinim/analiz yazılımındaki eşik seviyesini ayarlayarak arka plan gürültüsünün kaydedilmesini ortadan kaldırın.
- Şırınga üzerine hafif negatif basınç uygulayarak uygun herhangi bir periferik siniri emme elektroduna çekin.
not: Temel ateşleme frekansı, elektrot içine çekilen nöronların sayısı ile ilişkilidir, burada daha fazla nöron çoğu zaman elektrotun direncinin artmasına neden olur.
- CNS inen sinir aktivitesinin hücre dışı kaydına başlayın.
- Veri toplama yazılımında kaydı başlatın ve temel ateşleme frekansını izleyin. Temel ateşleme hızı verilerini toplamadan önce ateşleme hızının 5 dakika dengelenmesini bekleyin.
- Kontrol işleminin ateşlenme modeli Şekil 3A.
'da gösterilene benzer bir patlama modeli değilse, hazırlığı ve kaydı atın.
not: Değişmiş ateşleme modeli, merkezi model üretecinin anormal veya kararsız aktivitesini gösterir ve bu da nöral işlevi değiştirebilir.
- 5 dakika sonra, kontrol ateşleme hızlarını kaydetmeye başlamak için haznenin toplam hacmini 400 μL'ye getirmek için 200 μL tuzlu su + araç ekleyin.
- Taban çizgisi oluşturulduktan sonra (3-5 dakika), 200 μL salin çekin ve tuzlu su içinde çözündürülmüş deney ajanından 200 μL ekleyin.
not: Dimetil sülfoksit (DMSO), lipofilik bileşikler için önerilen çözücüdür ve %0,1 v/v'yi geçmemelidir.
- İlaç konsantrasyonlarını seri bir şekilde uygulayın (düşük ila yüksek konsantrasyonlar) ve her konsantrasyonu belirli bir süre boyunca kaydedin (ilacın kimyasal özelliklerine göre araştırmacı tarafından belirlenir). İlacın ve nihai konsantrasyonu içeren bir yorum ekleyerek edinim/analiz yazılımında ilaç uygulamasının bu zaman noktasını etiketleyin.
not: Diseksiyondan 30-50 dakika sonra SSS'nin ateşleme aktivitesi yaklaşık %10-20 oranında azalacaktır ve bu nedenle uygun tedavi edilmemiş kontroller yapılmalı ve ilaç tedavileri bu süreyi aşmamalıdır.
